Co-kultur modeller av Pseudomonas aeruginosa Biofilmer odlas på levande mänskliga Airway Cells
Summary
Detta dokument beskriver olika metoder att växa<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilmer på odlade humana luftvägar epitelceller. Dessa protokoll kan anpassas för att studera olika aspekter av biofilm bildning, inklusive visualisering av biofilm, färgning av biofilm, mäta kolonibildande enheter (CFU) av biofilm, och studera biofilm cytotoxicitet.
Abstract
Bakteriella biofilmer har förknippats med en rad olika mänskliga sjukdomar, men biofilm utvecklingen i allmänhet har studerats på icke-levande ytor. I denna skrift beskriver vi protokoll för att bilda Pseudomonas aeruginosa biofilmer på människors luftvägar epitelceller (CFBE celler) odlas i kultur. I den första metoden (sk Static Co-kultur Biofilm Model), P. aeruginosa är inkuberas med CFBE celler odlas som konfluenta monolager på vanliga tallrikar vävnadsodling. Även om bakterien är mycket giftigt för epitelceller, tillägg av arginin förseningar förstörelsen av cellslager tillräckligt länge för biofilmer till form på CFBE celler. Den andra metoden (sk Flow Cell Co-kultur Biofilm Model), innebär anpassning av en biofilm flödescell apparater, som ofta används i biofilmen forskning, för att rymma ett glas täckglas stödja en konfluenta monolager av CFBE celler. Detta cellslager är inokuleras med P. aeruginosa och en Slangpumpar rinner sedan färska medelstora över de celler. I båda systemen, bakteriella biofilmer form inom 6-8 timmar efter ympningen. Visualisering av biofilmen förstärks genom användning av P. aeruginosa-stammar som uttrycker konstitutivt grönt fluorescerande protein (GFP). De statiska och Flow Cell Co-kulturen Biofilm analyser modellsystem för tidig P. aeruginosa infektion i cystisk fibros (CF) lunga, och dessa tekniker möjliggör olika aspekter av P. aeruginosa biofilm bildning och virulens som skall studeras, inklusive biofilmen cytotoxicitet, mätning av biofilm CFU och färgning och visualisera biofilmen.
Protocol
Discussion
Biofilmer är samhällen av bakterier som bildas som svar på stimuli från omgivningen. Dessa miljö-signaler leder till globala förändringar av regelverket inom varje bakterie, vilket resulterar i att binda till en yta, sammanställning, produktion av exopolysaccharides, och andra fenotyper som ökad antibiotikaresistens 10. Under de senaste decennierna har mycket bevis stöder hypotesen att biofilmer spelar en stor roll i patogenesen av kroniska infektioner. Till exempel är det väl accepterat att P…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka G. O Toole för vägledning och förslag för att utveckla dessa modeller. Detta arbete stöddes av cystisk fibros stiftelsen (ANDERS06F0 till GGA, STANTO07RO och STANTO08GA till BAS), National Institutes of Health (T32A107363 till GGA och R01-HL074175 till BAS) och National Center for Forskning Centers for Biomedical Research Excellence (Cobre P20-RR018787 till BAS).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
Riferimenti
- Anderson, G. G., Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. In vitro analysis of tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms on cystic fibrosis-derived airway epithelial cells. Infect Immun. 76, 1423-1433 (2008).
- Bruscia, E. Isolation of CF cell lines corrected at DeltaF508-CFTR locus by SFHR-mediated targeting. Gene Ther. 9, 683-685 (2002).
- Cozens, A. L. CFTR expression and chloride secretion in polarized immortal human bronchial epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 10, 38-47 (1994).
- Hentchel-Franks, K. Activation of airway cl- secretion in human subjects by adenosine. Am J Respir Cell Mol Biol. 31, 140-146 (2004).
- Moreau-Marquis, S. The DeltaF508-CFTR mutation results in increased biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa by increasing iron availability. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295, 25-37 (2008).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, (2005).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146 (Pt 10), 2409-2415 (2000).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (Pt 10), 2395-2407 (2000).
- Anderson, G. G., Yahr, T. L., Lovewell, R. R., O’Toole, G. A. The Pseudomonas aeruginosa magnesium transporter MgtE inhibits transcription of the type III secretion system. Infect Immun. 78, (2010).
- Costerton, J. W. Overview of microbial biofilms. J Ind Microbiol. 15, 137-140 (1995).
- Hoiby, N., Frederiksen, B., Pressler, T. Eradication of early Pseudomonas aeruginosa infection. J Cyst Fibros. 4, 49-54 (2005).
- Ko, Y. H., Pedersen, P. L. Cystic fibrosis: a brief look at some highlights of a decade of research focused on elucidating and correcting the molecular basis of the disease. J Bioenerg Biomembr. 33, 513-521 (2001).
- Gibson, R. L., Burns, J. L., Ramsey, B. W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 168, 918-951 (2003).
- Furukawa, S., Kuchma, S. L., O’Toole, G. A. Keeping their options open: acute versus persistent infections. J Bacteriol. 188, 1211-1217 (2006).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, Unit 1B 1-Unit 1B 1 (2005).
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- Gomez, M. I., Prince, A. Opportunistic infections in lung disease: Pseudomonas infections in cystic fibrosis. Curr Opin Pharmacol. 7, 244-251 (2007).
