Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway
Summary
Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der wachsenden<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Biofilme auf kultivierten menschlichen Epithelzellen der Atemwege. Diese Protokolle können an unterschiedliche Aspekte der Bildung von Biofilmen, einschließlich Visualisierung der Biofilm-Studie, Färbung des Biofilms, der Messung der Kolonie-bildenden Einheiten (KBE) des Biofilms und Studium Biofilm Zytotoxizität werden.
Abstract
Bakterielle Biofilme sind mit einer Reihe von verschiedenen Krankheiten beim Menschen in Verbindung gebracht, aber Biofilm Entwicklung hat in der Regel auf nicht-lebenden Oberflächen untersucht. In diesem Papier beschreiben wir Protokolle zur Bildung Pseudomonas aeruginosa Biofilmen auf die menschliche Epithelzellen der Atemwege (CFBE Zellen) in Kultur gezüchtet. Bei der ersten Methode (der so genannten Static Co-Kultur Biofilm-Modell), P. aeruginosa ist mit CFBE Zellen Monolayers auf Standard-Zellkultur-Platten kultiviert inkubiert. Obwohl das Bakterium ist sehr giftig für Epithelzellen, die Zugabe von Arginin verzögert die Zerstörung der Monoschicht lange genug für Biofilme auf der CFBE Zellen bilden. Die zweite Methode (sog. Flow Cell Co-Kultur Biofilm Model), beinhaltet die Anpassung eines Biofilms Durchflusszelle Apparate, die oft in Biofilm-Forschung, wird ein Deckglas Unterstützung einer Monolayer von CFBE Zellen unterzubringen. Diese Monoschicht mit P. geimpft aeruginosa und eine peristaltische Pumpe fließt dann frisches Medium über die Zellen. In beiden Systemen bilden bakterielle Biofilme innerhalb von 6-8 Stunden nach der Impfung. Visualisierung des Biofilms wird durch die Verwendung von P. verbesserte aeruginosa-Stämme konstitutiv grün fluoreszierende Protein (GFP). Die statischen und Durchflusszelle Co-Kultur Biofilm-Assays sind Modellsysteme für die frühe P. aeruginosa-Infektion der Mukoviszidose (CF) Lunge, und diese Techniken ermöglichen unterschiedliche Aspekte der P. aeruginosa Biofilm-Bildung und Virulenz untersucht werden, einschließlich Biofilm Zytotoxizität, Messung von Biofilm CFU, und Färbung und Visualisierung der Biofilm.
Protocol
Discussion
Biofilme sind Gemeinschaften von Bakterien, die in Reaktion auf Reize aus der Umwelt zu bilden. Diese Signale aus der Umwelt auf globaler regulatorischer Veränderungen innerhalb jedes Bakterium, wodurch die Bindung an eine Oberfläche, Aggregation, Herstellung von Exopolysaccharide und andere Phänotypen wie erhöhte Antibiotikaresistenz 10 führen. In den letzten paar Jahrzehnten hat viele Beweise der Hypothese, dass Biofilme eine große Rolle spielen in der Pathogenese der chronischen Infektionen unterstü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten G. O Toole zur Orientierung und Anregungen bedanken bei der Entwicklung dieser Modelle. Diese Arbeit wurde von der Cystic Fibrosis Foundation (ANDERS06F0 zu GGA, STANTO07RO und STANTO08GA zu BAS), die National Institutes of Health (T32A107363 auf GGA und R01-HL074175 zu BAS) unterstützt wird, und dem National Center for Research Resources Centers for Biomedical Research Excellence (Cobre P20-RR018787 zu BAS).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS2 (Focht Live-Cell) chamber | Bioptechs, Butler, PA | 060319131616 | ||
| FCS2 chamber controller | Bioptechs, Butler, PA | 060319-2-0303 | ||
| 40 mm glass coverslips | Bioptechs, Butler, PA | PH 40-1313-0319 | ||
| MEM | Mediatech, Manassass, VA | #10-010-CV | ||
| MEM without phenol red | Mediatech, Manassass, VA | Mediatech, Manassass, VA |
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