Testing Protozoacidal di Ligand-litica Peptidi Contro Gut Termite protozoi In vitro (Cultura protozoi) e In vivo (Microiniezione in Termite hindgut)

Sommario

Vi presentiamo le procedure per dimostrare che ligandi si legano alla membrana superficiale della cellulosa digestione protozoi nell'intestino delle termiti di Formosa sotterraneo usando la microscopia a fluorescenza e che ligandi accoppiato con peptidi litici uccidere questi protozoi In vitro (Anaerobica cultura protozoi) e In vivo (Iniezione nel hindgut termite).

Abstract

Stiamo sviluppando un nuovo approccio per il controllo delle termiti sotterranee che avrebbe portato alla ridotta dipendenza l'uso di pesticidi chimici. Termiti sotterranee dipendono da protozoi del hindguts dei lavoratori di digerire in modo efficiente legno. Peptidi litici hanno dimostrato di uccidere una varietà di protozoi parassiti (Mutwiri et al. 2000) e anche protozoi nell'intestino della termite Formosa sotterraneo, Coptotermes formosanus (Husseneder e Collier 2009). Peptidi litici sono parte del sistema immunitario aspecifico degli eucarioti, e distruggere le membrane di microrganismi (Leuschner e Hansel 2004). La maggior parte dei peptidi litici non sono suscettibili di nuocere eucarioti superiori, perché non influiscono sul elettricamente neutro colesterolo contenenti le membrane delle cellule di eucarioti superiori (Javadpour et al. 1996). Azione del peptide litica può essere mirata a specifici tipi cellulari con l'aggiunta di un legante. Per esempio, Hansel et al. (2007) ha riferito che peptidi litici coniugati con ligandi dei recettori di membrana di cellule di cancro potrebbero essere utilizzati per distruggere le cellule tumorali del seno, mentre peptidi litici da solo o coniugato con non specifici peptidi non sono stati efficaci. Peptidi litici inoltre sono stati coniugati con ormoni umani che si legano ai recettori sulle cellule tumorali per la distruzione mirata delle cellule del cancro alla prostata e ai testicoli (Leuschner e Hansel 2004).

In questo articolo presentiamo le tecniche utilizzate per dimostrare l'attività protozoacidal di un peptide litico (Ecate), accoppiato ad un ligando eptapeptide che si lega alla membrana superficiale di protozoi dall'intestino di termiti sotterranee Formosa. Queste tecniche includono estirpazione dell'intestino dai lavoratori delle termiti, la cultura anaerobica di budello protozoi (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), la conferma microscopici che il legante marcato con un colorante fluorescente si lega l'intestino termite protozoi e altri protozoi a vita libera ma non di batteri o tessuto intestinale. Abbiamo anche dimostrato che il legante stesso accoppiato ad un peptide litici uccide in modo efficiente intestino termite protozoi in vitro (cultura protozoi) e in vivo (microiniezione in hindgut dei lavoratori), ma è meno bacteriacidal che il peptide litica da sola. La perdita di protozoi porta alla morte delle termiti in meno di due settimane.

In futuro, saremo geneticamente ingegnere microrganismi che possono sopravvivere nel hindgut termiti e diffondere attraverso una colonia di termiti come "cavalli di Troia" per esprimere ligando-litica peptidi che avrebbero ucciso i protozoi nell'intestino delle termiti e successivamente uccidere le termiti nella colonia . Ligando-litica peptidi potrebbe anche essere utile per lo sviluppo di farmaci contro protozoi parassiti.

Protocollo

Esperimento 1: Estrazione del budello termiti protozoi in condizioni anaerobiche

1. Utilizzare una casella di fan (Laboratori Coy) in un vano portaoggetti per far circolare sempre aria attraverso un disseccante e il tipo D catalizzatore Stak-Paks per controllare l'umidità ei livelli di ossigeno e di eliminare le temperature irregolari. Riempire il vano portaoggetti con un flusso continuo di azoto per 20 a 30 min. Monitorare i livelli di ossigeno con un sensore di ossigeno (C-squared, Inc.) per 1 h. Utilizzare l'azoto per raggiungere e mantenere condizioni anaerobiche, quando necessario.
2. Preparare Trager U media (Trager 1934) e aggiustare il pH a 7,0....

Discussione

Ligando-litica peptidi sono stati utilizzati con successo per raggiungere in modo efficace e distruggere le cellule tumorali (Hansel e Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Sulla base di questo concetto, abbiamo sviluppato un ligando eptapeptide che si lega alla superficie di protozoi nell'intestino delle termiti di Formosa sotterranee e accoppiato a un peptide litica con l'obiettivo di distruggere queste obbligare cellulosa digerire simbionti nell'intestino delle termiti per raggiungere termite cont.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Sigmacote	Sigma-Aldrich	SL-2
EDANS	Novabiochem, EMD Millipore
Camera anaerobica a guanto	Coy Laboratories, Inc.	Personalizzata
Controllore ambientale Intellus	Percival Scientific, Inc.	I36NL
Trattore per micropipette in vetro PC-10	Narishige International	PC-10
Aghi di vetro (Modello GD-1, 1 X 900 mm)	Narishige International	GD-1
Micromanipolatori Leitz	Vermont Optechs, Inc.	ACS01
Micoiniettore	Tritech Research, Inc.	MINJ-1
Microcaps	Drummond Scientific	1-000-0005
Sistema di imaging a fluorescenza LEICA	Leica Microsystems	DMRxA2
Microscopio stereoscopico LEICA	Leica Microsystems	MZ16
Microscopio LEICA	Leica Microsystems	DMLB
Microscopio stereoscopico Olympus	Olympus Corporation	SZ61