Prueba de Actividad Protozoacidal de ligando-lítica péptidos intestinales contra termitas protozoos In vitro (Cultura protozoos) y In vivo (Microinyección en termitas intestino grueso)
Summary
Se presentan los procedimientos para demostrar que los ligandos se unen a la membrana de la superficie de la celulosa para digerir estos protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa utilizando microscopía de fluorescencia y los ligandos que, junto con los péptidos líticos matar protozoarios<em> In vitro</em> (Cultivo de anaerobios protozoos) y<em> In vivo</em> (Inyección en el intestino grueso de termitas).
Abstract
Estamos desarrollando un nuevo enfoque para el control de termitas subterráneas que conducirían a una menor dependencia del uso de pesticidas químicos. Las termitas subterráneas son dependientes de los protozoos en el hindguts de los trabajadores para digerir eficientemente la madera. Péptidos líticos se ha demostrado que matar a una variedad de parásitos protozoarios (Mutwiri et al. 2000) y protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa, Coptotermes formosanus (Husseneder y Collier 2009). Péptidos líticos son parte del sistema inmunológico inespecífico de los eucariotas, y destruir las membranas de los microorganismos (Leuschner y Hansel, 2004). La mayoría de los péptidos líticos no pueden perjudicar a los eucariotas superiores, porque no afectan a la eléctricamente neutros que contienen colesterol de las membranas celulares eucariotas superiores (Javadpour et al. 1996). La acción de péptidos líticos pueden ser dirigidos a tipos específicos de células mediante la adición de un ligando. Por ejemplo, Hansel et al. (2007) informó que los péptidos líticos conjugado con ligandos celulares de cáncer receptor de membrana podría usarse para destruir las células de cáncer de mama, mientras que los péptidos líticos solos o conjugados con los no-péptidos específicos no fueron efectivos. Péptidos líticos también se han conjugado con las hormonas humanas que se unen a los receptores en las células tumorales para la destrucción selectiva de la próstata y las células de cáncer de testículo (Leuschner y Hansel, 2004).
En este artículo se presentan las técnicas utilizadas para demostrar la actividad protozoacidal de un péptido lítico (Hécate), junto a un ligando heptapéptido que se une a la membrana de la superficie de los protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa. Estas técnicas incluyen la extirpación del intestino de las termitas obreras, la cultura anaeróbica de los intestinos protozoos (Pseudotrichonympha grassii, Holomastigotoides hartmanni,
Spirotrichonympha leidyi), confirmación microscópica que el ligando marcado con un tinte fluorescente se une al intestino de termitas protozoos y otros protozoos de vida libre, pero no a las bacterias o tejido intestinal. También demuestran que el mismo ligando unido a un péptido lítico eficiente mata termitas protozoos intestinales in vitro (cultivo de protozoos) e di vivo (microinyección en el intestino posterior de los trabajadores), pero es menos bactericida que el péptido lítico solo. La pérdida de protozoos lleva a la muerte de las termitas en menos de dos semanas.
En el futuro, que será genéticamente ingeniero de microorganismos que pueden sobrevivir en el intestino de termitas y la difusión a través de una colonia de termitas como "Caballos de Troya" para expresar ligando-lítica péptidos que matar a los protozoos en el intestino de termitas y posteriormente matar a las termitas en la colonia . Ligando-lítica péptidos también podrían ser útiles para el desarrollo de medicamentos contra los parásitos protozoarios.
Protocol
Discussion
Ligando-lítica péptidos se han utilizado con éxito para hacer frente eficazmente y destruir las células cancerosas (Hansel y Leuschner 2004, Hansel et al. 2007). Basado en este concepto, hemos desarrollado un ligando heptapéptido que se une a la superficie de los protozoos en el intestino de las termitas subterráneas de Formosa y junto a un péptido lítico con el objetivo de destruir estos obligan digerir la celulosa-simbiontes en el intestino de las termitas para conseguir termitas control (Husseneder y…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Richard Allison, ex director de la instalación de péptido LSU para la síntesis de ligandos fluorescentes, el Centro de Investigación de Biotecnología Interdisciplinaray, UF para la síntesis del péptido ligando-lítica, y la instalación del microscopio Socolovsky para facilitar el acceso a los microscopios de fluorescencia. El financiamiento fue proporcionado por el Programa de Desarrollo SERDP exploratorio (SEED) del Departamento de Defensa, el Departamento de Energía y la Agencia de Protección Ambiental, el Programa de Biotecnología AgCenter Equipo Interdisciplinario y el estado de Louisiana.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sigmacote | Sigma Aldrich | SL-2 | ||
| EDANS | Novabiochem | |||
| Anaerobic glove box | Coy Laboratories, Inc. | Custom made | ||
| Intellus environmental controller | Percival | I36NL | ||
| PC-10 Glass micropipette puller | Narishige Scientific Instrument Lab | PC-10 | ||
| Glass needles (Model GD-1, 1 X 900 mm) | Narishige Scientific Instrument Lab | GD-1 | ||
| Leitz micromanipulators | Vermont Optechs, Inc. | ACS01 | ||
| Microinjector | Tritech Research, Inc. | MINJ-1 | ||
| Microcaps | Drummond Scientific Company | 1-000-0005 | ||
| LEICA fluorescence imaging system | Leica | DMRxA2 | ||
| LEICA dissecting scope | Leica | MZ16 | ||
| LEICA microscope | Leica | DMLB | ||
| Olympus dissecting scope | Olympus | SZ61 |
Riferimenti
- Hansel, W., Leuschner, C., Enright, F. Conjugates of lytic peptides and LHRH or βCG target and cause necrosis of prostate cancers and metastases. Mol. Cell. Endocrinol. 269, 26-33 (2007).
- Husseneder, C., Collier, R. E., Bourtzis, K., Miller, T. A. Paratransgenesis for termite control. Insect Symbiosis. 3, 361-376 (2009).
- Husseneder, C., Grace, J. K., Oishi, D. E. Use of genetically engineered bacteria (Escherichia coli) to monitor ingestion, loss and transfer of bacteria in termites. Curr. Microbiol. 50, 119-123 (2005).
- Husseneder, C., Grace, J. K. Genetically engineered termite gut bacteria deliver and spread foreign genes in termite colonies. Appl. Microbiol. Biotechnol. 68, 360-367 (2005).
- Javadpour, M. M., Juban, M. M., Lo, W. C., Bishop, S. M., Alberty, J. B., Cowell, S. M., Becker, C. L., Mc Laughlin, M. L. De novo antimicrobial peptides with low mammalian cell toxicity. J. Med. Chem. 39, 3107-3113 (1996).
- Lai, P. Y., Tamashiro, M., Fuji, J. K. Abundance and distribution of the three species of symbiotic protozoa in the hindgut of Coptotermes formosanus (Isoptera). Proc. Haw. Entomol. Soc. 24, 271-276 (1983).
- Leuschner, C., Hansel, W. Membrane disrupting lytic peptides for cancer treatments. Curr. Pharm. Des. 10, 2299-2310 (2004).
- Mutwiri, G. K., Henk, W. G., Enright, F. M., Corbeil, L. B. Effect of the Antimicrobial Peptide, d-Hecate, on Trichomonads. J. Parasitol. 86, 1355-1359 (2000).
- Trager, W. The cultivation of a cellulose-digesting flagellate, Trichomonas termopsidis, and of certain other termite protozoa. Biol. Bull. 66, 182-190 (1934).
