我々は、傷害の発症前に脳を保護するための治療薬の開発のための新たなターゲットを特定する手段として、コールドプレコンディショニングを担当し神経免疫シグナルを定義しようとしています。我々は生物学的システム、実験操作に加え、再現性の高いと小文字が区別される技術的能力を必要とするような作業のための戦略を提示する。
神経損傷は、全身麻酔と、効果的な管理が容易で安全なプレコンディショニング治療法の開発により軽減することができる関連する外科的処置の罹患率と死亡率の原因となることが多い。我々は、傷害の発症前に脳を保護するための治療薬の開発のための新たなターゲットを特定する手段として、コールドプレコンディショニングを担当し神経免疫シグナルを定義しようとしています。時間の経過に伴う変化をシグナリング低レベルのプロ炎症性メディエーターは、冷間プレコンディショニング神経保護のために不可欠です。このシグナリングは、刺激性の刺激が明らかになることを保護するための刺激に適応するための十分な時間と閾値の大きさに達することを必要と生理的なコンディショニングのホルミシスの基本的な教義と一致しています。
従って、冷間プレコンディショニング神経保護に関与する免疫シグナルの線引きは、生物学的システムと実験操作に加え、技術的能力が高い再現性と小文字を区別することが必要です。我々のアプローチは密接に成熟しており、静止大膠細胞/ミクログリアの影響を受けた多シナプスニューラルネットワークによる生体のカウンターでを反映するin vitroモデルとしての海馬のスライス培養を使用することです。彼らはフェムトモル範囲の手術であるサイトカイン、の主要な供給源であるため、このグリア状態では、ミクログリアのために特に重要です。また、スライス培養、活性化刺激を呼び起こすと適応応答を評価するために十分な時間である、数週間のためにin vitroで維持することができます。最後に、環境条件を正確にそのサイトカインがコールドプレコンディショニングのシグナリングようにスライス培養を用いて制御することができるが、測定模倣、および重要なノードの側面を分析するように変調することができます。サイトカインシグナル伝達系の解析では、高感度で再現性の多重化技術を使用する必要があります。我々は、組織全体のサイトカインの変化を評価する定量的リアルタイム定量PCRアレイのスクリーニングに続いてミクログリアの活性化のために画面にTNF -αのために定量PCRを使用してください。後者は、同時に変更を通知する複数のサイトカインのシステムを測定する最も高感度で再現性の手段です。重要な変更は、対象となる定量PCRしてから、蛋白質の検出により確認されています。我々はLuminexの技術を使用して多重化ミクロスフェアのフローサイトメトリーアッセイを用いて組織ベースのサイトカインタンパク質の変化を探る。細胞特異的サイトカイン産生は、二重ラベルの免疫組織化学で決定されます。一緒になって、提案された調査の戦略に結合この脳組織の調製および使用のスタイルは、、コールドプレコンディショニングの利点を模倣することができる新たな治療法の開発のための潜在的なターゲットを特定するための最適なアプローチかもしれない。
コールド – プレコンディショニング神経保護に関与サイトカインシグナル伝達系の描写に重要な二つの根本的に重要な概念は、図6と図7に示されています。最初に、サイトカインは通常の脳内シグナル伝達分子が非常に低濃度です。それにもかかわらず、生理的サイトカイン濃度の変化は、遺伝子の発現を変化させる能力(図6)の脳の構造と機能(すなわち、表現型)を変更するために計り知れない可能性を秘めている。さらに、サイトカインは、同様の効果と、単一のサイトカインが変数の効果(図7)を持つことができますを持つことが非常に冗長とその複数のサイトカインの多面的です。従って、正確に冷間前処理演算子(または他の生理的前処理の刺激)から神経保護作用のための生得的なサイトカイン拠点を確立するために、関連するシグナリング変数の複合解析を判定する必要があります。これは、多重化アッセイ戦略によって実現されます。これは、コールドプレコンディショニング神経保護のサイトカイン"署名"を設立します。
図6。脳内サイトカインのシグナル伝達のパワー。イラストは他のよく知ら対応の濃度に比べて脳のサイトカインの生理的濃度の巨大なシグナル伝達力を伝える。濃度は、基準点として、単一の猫のひげをはじめ、距離の逆数として表されます。ナトリウム(コショウの粒で示される10 -1 M)およびカリウム(トマトで示される10 -3 M)は、内の役割はそれぞれ約150及び3mMの、のレベルで間質脳空間に存在し、十分に認識している神経細胞の電気生理学的機能。同様に、pH(すなわち、〜10 -7 Mの水素イオンの濃度とシカゴの湖畔に沿って780メートルとして図示)とカルシウム(すなわち、7.8キロマコーミックからシカゴの湖畔に沿って衛星Googleの画像から見て示すように、〜10 -8 Mの濃度)シカゴ大学の近くにハイドパークでのプロモントリーポイントに置きます。さらに、これらの濃度以上の間隙に放出された神経伝達物質は、局所脳領域の活性に影響を与える。対照的に、サイトカインは、(地球から火星までの距離として示されている)十数万倍未満の濃度で脳の機能を変更することができます。
図7。生得的なサイトカイン経路のインタラクティブなシグナリング。サイトカインは、非常に冗長とその複数のサイトカインの多面的なものは、同様の効果を持つことができ、単一のサイトカインは、変数の効果を持つことができます。そのような多様性は、リガンド、受容体、およびリン酸化のレベルで発生する複雑な対話型のシグナリングに由来する。さらに複雑さは、セル固有の生得的なサイトカイン、受容体、および関連するリン酸化タンパク質の変化の各能力で、脳が別の細胞型から構成されているという事実から生じている。ここに例示を目的として、唯一の生得的なサイトカインシグナル伝達経路は、(免疫細胞の研究から派生)が表示されます。単純にするために、脳は生得的なサイトカインの潜在的な相互作用を示す単セル(白い線)((IL -1α/βとしてここに呼ばれる)、IL -1αおよびIL -1β、TNF -α、IL – 6、として描かれているIFN -γとIL – 10)、受容体(IL – 1R1、TNFR1、IL-6/gp130、IFNγR、およびIL – 10R)、およびリン酸化タンパク質(すなわち、キナーゼERK1 / 2、P38(P38 – MAPK)やJNK)と転写因子(ATF – 2、NFκB、およびSTAT3)。 TNFR1を介したATF – 2を介して遺伝子発現を誘発するJNK、p38の- MAPKおよびERK1 / 2、に例えば、TNF -αシグナル。 TNF -αはまた、NFκB活性化を介して直接遺伝子発現を変化させる。示されるように一緒に、これらの転写因子の活性化は、サイトカインとその受容体の増加(矢印)と減少した(平滑末端)式を呼び起こす。重要なことは、これらの経路は、他の(例えば、IL -1β)サイトカインの一つサイトカインの変化(例えば、TNF -α)の影響の生産を示している。従って、正確に確立するために関連するシグナリング変数の冷間前処理演算子、複合解析から神経保護のためのサイトカインの塩基は決定されなければならない。これは、コールドプレコンディショニングの生得的なサイトカイン"署名"を設立します。 (画像を参照#25のデータから、コンパイルされています。)
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立神経疾患研究所およびストローク(NS – 19108)、片頭痛研究財団、そしてリチャードP.クレイグへホワイト財団からの補助金によって賄われていた。さんマーシャP.クレイグは、培地およびスライス培養のメンテナンスの準備に協力した。我々は、この記事の最終版の彼女のコメントやリビジョンのためエレーナグリンベルクに感謝。
Preparation of Slice Cultures
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
Millicell-CM tissue culture inserts (30 mm) | Thermo Fisher | PICM0-3050 | |
Basal Medium Eagle | Invitrogen | 21010 | |
Earle s Balanced Salt Solution | Sigma | E2888 | |
Horse serum | Invitrogen | 26050-088 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15710-064 | |
Fungizone | Invitrogen | 15295 | |
D-glucose | Sigma | G8769 | |
BSL-1 fume hood | Baker | ||
McIlwain tissue chopper | Brinkmann | ||
Teflon disks | Brinkmann | 023-49-310-1 | |
Spatula | Thermo Fisher | 14-373-25A | |
Curved iris scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Long straight scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
Long forceps | Thermo Fisher | 13-812-40 | |
Angled forceps | Fine Science Tools | 11808-02 | |
Short forceps | Thermo Fisher | 13-812-38 | |
#5 Inox forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
2 Iris spatulae | Fine Science Tools | 10094-13 | |
150 x 15 mm Petri dishes | Thermo Fisher | 08-757-148 | |
60 x 15 mm Petri dishes | Thermo Fisher | 08-757-100B | |
Wild M8 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | ||
Gey s balance salt solution | Sigma | G9779 | |
Blak-Ray shortwave Ultraviolet measuring meter | UVP | J-225 | |
6-well Falcon culture dishes | Thermo Fisher | 08-772-1B | |
Neurobasal | Invitrogen | 21103 | |
B27 supplement | Invitrogen | 17504 | |
Gem21 Neuroplex | Gemini Bioproducts | 400-160-010 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
CO2 Analyzer | Bacharach | #2820 |
Pre-screening for Vitality of Slice Cultures
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
Sytox Green | Invitrogen | S7020 | |
DMIBRE inverted microscope | Leica |
Cold-Preconditioning
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
BSL-2 Fume Hood | NuAire |
Excitotoxic Injury
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
CoolSnap fx CCD camera | Photometrics | ||
Fluoroscein | Invitrogen | F36915 | |
MetaMorph software | Molecular Devices | v. 7.5.04 | |
100 μm deep hemacytometer | Hausser Scientific | ||
N-methyl-D-aspartate | Calbiochem | 454575 | |
SigmaStat software | Systat Software Inc. | v. 3.5 |
Co-treatments applied with Cold-Preconditioning
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
sTNFR1 | R & D Systems | 425-R1-050 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-4503 |
RNA Isolation
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
RNAlater | Ambion | AM7021 | |
Micro RNEasy Kit | Qiagen | 74004 | |
β-mercaptoethanol | Fisher | 03446-100 | |
Diposable 1.5 RNAse-free Pestle |
South Jersey Precision Tool and Mold, Inc. | 749521-1590 | |
RNasin | Promega | N261A | |
Tris[hydroxymethyl]aminomethane | Sigma | T3069 | |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt hydrate | Sigma | #E7889 |
RNA Quantification
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
RiboGreen Assay | Invitrogen | R11491 | |
Yeast tRNA | Invitrogen | 15401-011 | |
1.5 mL centrifuge tubes | USA Scientific | 16155500 | |
96-well fluorescent assay plate | Nunc | DK-4000 | |
96-well fluorescent plate reader | Tecan | Safire II |
Quantitative PCR
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
iScript reverse transcription kit | Bio-Rad | 170-8891 | |
SYBR Green | Invitrogen | S7563 | |
Platinum Taq polymerase | Invitrogen | RNA Ultrasense 11732-927 | |
iCycler thermocycler | Bio-Rad | iCycler Optical Module | |
iCycler system software | Bio-Rad | v. 3.1 |
Quantitative PCR for Microarrays
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
RNase Away | Molecular BioProducts | #7000 | |
RT2 First Strand Kit | SABiosciences | C-03 | |
SYBR Green-based PCR mix | SABiosciences | PA-011 | Specific for iCycler |
RT2 Profiler PCR Array | SABiosciences | PARN-011A |
Proteomic Assay
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
Cell lysis kit | Bio-Rad | 171-304011 | |
Microcentrifuge | Fisher Scientific | Micro 7 | |
BSA protein stock | Bio-Rad | 500-0007 | |
BCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Immuno 96 MicroWell plates | Nunc | 449824 | |
Sealing tape | Bio-Rad | 2239444 | |
96-well plate reader | Perkin Elmer | 1420-mulilabel counter | |
Bioplex Rat TNF-α cytokine assay | Bio-Rad | X0000001T |
Immunostaining
Name of Reagent/Equipment | Company | Catalogue/Model Number | Comments |
16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
Lysine | Sigma | L-6001 | |
Sodium phosphate | Fisher Scientific | S374-1 | |
Sodium periodate | Sigma | S-1878 | |
Sodium azide | Sigma | S-2002 | |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | H1009 | |
Goat serum | Colorado Serum Company | CS 0920 | |
Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
Staining dishes | Ted Pella, Inc. | 14511 | |
Plate Shaker | Lab-Line Instruments, Inc. | 3520 | |
#1 Filter Papers (185 mm) | Whatman | 1001-185 | |
3,3 -diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Xylene | Fisher Scientific | X3S-4 | |
Permount mounting media | Fisher Scientific | SP15-100 | |
Cryostat | Leica | cm3050 S | |
Tissue-Tek | Ted Pella, Inc. | 27050 | |
Fine-tip paint brush | Ted Pella | 11806 | |
PAP blocking pen | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SFX signal enhancer | Invitrogen | A31631 | |
ProLong Antifade | Invitrogen | P7481 |