Analisi al microscopio di γH2AX focolai, che formano in seguito alla fosforilazione di H2AX a livello della serina-139 in risposta a DNA a doppio filamento, è diventato uno strumento prezioso nel campo della biologia delle radiazioni. Qui abbiamo usato un anticorpo mono-istone H3 metilato in lisina 4 come marker epigenetici attivamente eucromatina di trascrizione, di valutare la distribuzione spaziale della radiazione indotta formazione γH2AX all'interno del nucleo.
Una risposta precoce molecolare a DNA a doppio filamento (DSB) è la fosforilazione della Ser-139 residui all'interno del motivo terminale SQEY del 1,2 istone H2AX. Questa fosforilazione di H2AX è mediato dalla fosfatidil-inosito 3-chinasi (PI3K) famiglia di proteine, atassia telangiectasia mutati (ATM), DNA-proteina chinasi subunità catalitiche e ATM e RAD3-correlate (ATR) 3. La forma fosforilata di H2AX, denominato γH2AX, si estende alle regioni limitrofe della cromatina dal sito del DSB, formando focolai distinti, che sono facilmente visibili al microscopio immunofluorecence 3. L'analisi e la quantificazione di γH2AX focolai è stato ampiamente utilizzato per valutare la formazione di DSB e la riparazione, in particolare in risposta alle radiazioni ionizzanti e per valutare l'efficacia di radiazione modificando vari composti e composti citotossici 4.
Data la specificità e la squisita sensibilità di questo marcatore de novo di DSB, ha fornito nuove informazioni sui processi di danno e riparazione del DNA nel contesto della cromatina. Ad esempio, nella biologia radiazione il paradigma centrale è che il DNA nucleare è l'obiettivo fondamentale rispetto alla sensibilità alle radiazioni. Infatti, il consenso generale del settore è stato in gran parte per visualizzare cromatina come un modello omogeneo per danno e riparazione del DNA. Tuttavia, con l'uso di γH2AX come marcatore molecolare di DSB, una disparità di γ-irradiazione indotto la formazione di focolai in γH2AX eucromatina ed eterocromatina è stato osservato 5-7. Recentemente, abbiamo utilizzato un pannello di anticorpi sia mono-, di-o tri-istone H3 metilato in lisina 9 (H3K9me1, H3K9me2, H3K9me3) che sono impronte epigenetiche di eterocromatina costitutiva e silenziamento trascrizionale e lisina 4 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3 ), che sono strettamente correlate attivamente trascrizione regioni eucromatiche, per studiare la distribuzione spaziale delle γH2AX seguenti radiazioni ionizzanti 8. In conformità con le idee prevalenti quanto riguarda la biologia della cromatina, i nostri risultati indicato una stretta correlazione tra la formazione e la trascrizione γH2AX attivo 9. Qui mostriamo il nostro metodo di immunofluorescenza per la rilevazione e quantificazione di γH2AX focolai in cellule non-aderenti, con un focus particolare sulla co-localizzazione con altri marcatori epigenetici, analisi di immagine e di modellazione 3D.
The authors have nothing to disclose.
Il sostegno della Australian Institute of Nuclear Science and Engineering è riconosciuto. TCK è stato il destinatario di premi AINSE. Lab Medicina epigenomic è supportata dal National Health and Medical Research Council of Australia (566.559). Questo lavoro è finanziato dal CRC for Biomedical Imaging Development Ltd, con sede e supportato in Centri di Ricerca Cooperativa il governo australiano s (CRC) del programma. LM è supportato da Melbourne di ricerca (Università di Melbourne) e borse di studio integrative Biomedical Imaging CRC. Il supporto di Monash Micro Imaging (Dr. Stephen Cody e Iska Carmichael) è stata preziosa per questo lavoro.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Roswell Park Memorial Institute -1640 (RPMI-1640) | Growth medium | Invitrogen | 22400071 | RPMI-1640, pH 7.4 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine, 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, 20mM (HEPES) N-2-Hydroxyethylpiperazine-N’-2-Ethanesulfonic Acid |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | ||
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | BSA (1%) is used to block any non-specific antibody binding. Primary and secondary antibodies are diluted in BSA. | |
PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Invitrogen | 17-517Q | ||
Trypan blue | Sigma Aldrich | T6146 | Used to distinguish between live and dead cells. | |
Triton X-100 | Reagent | Sigma-Aldrich | T8787 | Triton X-100 (0.1%) used to permeabilise cells. |
Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | 158127 | Paraformaldehyde (4%) used to fix cells. |
Mouse monoclonal anti-phospho histone-H2AX antibody | Primary Antibody | Millipore, USA | 16193 | Dilution of primary antibody (1:500), in 1% BSA. |
HistoneH3 (Mono-methyl K4) | Primary Antibody | Abcam, Cambridge, UK | AB8895 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11029 | Dilution of secondary antibody (1:500), in 1% BSA. |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Secondary Antibody | Invitrogen, USA | 11035 | |
TOPRO3 | DNA Stain | Invitrogen, USA | T3605 | TOPRO3 is a DNA dye with an Abs/Em of 642/661 nm. DAPI could be used if the confocal microscope is equipped with a 405 nm laser. |
ProLong Gold | Anti-fade solution | Invitrogen | P36930 | This glycerol based mounting medium must be used with an oil based lense that matches its refractive index. |
Polylysine slides | Menzel-Gläser, Germany | |||
Coverslips (22x50mm) | Coverslips | Menzel-Gläser, Germany | CS2250100 | |
Tissue Culture Flask, Vented Cap | Culture Flask | BD Falcon | 353112 | |
Shandon Cytospin 4 | ThermoElectron Corp | |||
Cytofunnels | Shandon, Inc. | |||
Filter Cards | Shandon, Inc | 353025 | ||
Coplin Jar, glass | Grale Scientific P/L | 1771-OG | ||
Staining Trough | Grale Scientific P/L | V1991.99 | ||
PAP Pen | Zymed Laboratories, Invitrogen | 008877 | ||
Gammacell 1000 Elite Irradiator | Gamma Irradiator | Nordion International Inc. | ||
Zeiss LSM 510 Meta Confocal | Confocal Microscope | Equipped with 3 lasers: 488 nm, 543 nm and 633 nm. | ||
Metamorph | Software for Imaging analysis | Molecular Devices, USA |