सेल संस्कृति के दौरान सेल नंबर निर्धारण राजाधिकार सेल काउंटर का उपयोग

Summary

राजाधिकार सेल काउंटर एक हाथ में स्वचालित उपकरण है कि कोशिकाओं गिनती करने के लिए, सेल व्यास और मात्रा की निगरानी, ​​और एक संस्कृति से अगले करने के लिए और सेलुलर आबादी के स्वास्थ्य की गुणवत्ता की जांच के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Abstract

Counting cells is often a necessary but tedious step for in vitro cell culture. Consistent cell concentrations ensure experimental reproducibility and accuracy. Cell counts are important for monitoring cell health and proliferation rate, assessing immortalization or transformation, seeding cells for subsequent experiments, transfection or infection, and preparing for cell-based assays. It is important that cell counts be accurate, consistent, and fast, particularly for quantitative measurements of cellular responses.

Despite this need for speed and accuracy in cell counting, 71% of 400 researchers surveyed¹ who count cells using a hemocytometer. While hemocytometry is inexpensive, it is laborious and subject to user bias and misuse, which results in inaccurate counts. Hemocytometers are made of special optical glass on which cell suspensions are loaded in specified volumes and counted under a microscope. Sources of errors in hemocytometry include: uneven cell distribution in the sample, too many or too few cells in the sample, subjective decisions as to whether a given cell falls within the defined counting area, contamination of the hemocytometer, user-to-user variation, and variation of hemocytometer filling rate².

To alleviate the tedium associated with manual counting, 29% of researchers count cells using automated cell counting devices; these include vision-based counters, systems that detect cells using the Coulter principle, or flow cytometry¹. For most researchers, the main barrier to using an automated system is the price associated with these large benchtop instruments¹.

The Scepter cell counter is an automated handheld device that offers the automation and accuracy of Coulter counting at a relatively low cost. The system employs the Coulter principle of impedance-based particle detection³ in a miniaturized format using a combination of analog and digital hardware for sensing, signal processing, data storage, and graphical display. The disposable tip is engineered with a microfabricated, cell- sensing zone that enables discrimination by cell size and cell volume at sub-micron and sub-picoliter resolution. Enhanced with precision liquid-handling channels and electronics, the Scepter cell counter reports cell population statistics graphically displayed as a histogram.

Protocol

1. सेल गिनती का महत्व कोशिकाओं गिनती के लिए इन विट्रो सेल संस्कृति में एक आवश्यक लेकिन थकाऊ कदम है. अनुरूप सेल सांद्रता प्रयोगात्मक reproducibility और सटीकता सुनिश्चित करते हैं. सेल गिनती सेल स्वास्थ्य और प्रसार की दर की निगरानी, ​​अमरता या परिवर्तन के आकलन, बाद में प्रयोगों अभिकर्मक, या संक्रमण के लिए कोशिकाओं बोने, और सेल आधारित assays के लिए तैयारी करने के लिए महत्वपूर्ण हैं. सेल गिनती में गति और सटीकता की आवश्यकता, 400 गिनती एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं सर्वेक्षण शोधकर्ताओं के 71% के बावजूद. जबकि hemocytometry सस्ती है, यह श्रमसाध्य और उपयोगकर्ता पूर्वाग्रह और दुरुपयोग है, जो गलत मायने में परिणाम के अधीन है. नमूने में सेल असमान वितरण भी कई या नमूने में भी कुछ कोशिकाओं, कि क्या एक दिया सेल परिभाषित गिनती क्षेत्र के भीतर गिर करने के लिए के रूप में व्यक्तिपरक निर्णय hemocytometer के संदूषण, उपयोगकर्ता के लिए उपयोगकर्ता भिन्नता hemocytometry में त्रुटि के सूत्रों का कहना है शामिल हैं: hemocytometer भरने की दर के परिवर्तन और. पुस्तिका गिनती के साथ जुड़े उदासी कम करने के लिए, शोधकर्ताओं की 29% स्वचालित सेल गिनती उपकरणों का उपयोग कोशिकाओं गिनती. हालांकि, सबसे शोधकर्ताओं के लिए, इन बड़े बेंच टॉप उपकरणों के साथ जुड़े मूल्य उनके उपयोग करने के लिए एक बाधा है. राजाधिकार सेल काउंटर एक स्वचालित हाथ में डिवाइस है कि स्वचालन और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर कल्टर गिनती की सटीकता प्रदान करता है. प्रणाली संवेदन, सिग्नल प्रोसेसिंग, डाटा भंडारण, और आलेखीय प्रदर्शन के लिए एनालॉग और डिजिटल हार्डवेयर के संयोजन का उपयोग कर एक छोटी प्रारूप में प्रतिबाधा आधारित कण का पता लगाने के कल्टर सिद्धांत कार्यरत हैं. डिस्पोजेबल सेंसर एक microfabricated, सेल क्षेत्र संवेदन कि सेल आकार और उप माइक्रोन और उप – picoliter संकल्प सेल की मात्रा के द्वारा भेदभाव सक्षम बनाता है इंजीनियर के साथ है. सटीक तरल से निपटने चैनलों और इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ बढ़ी, राजाधिकार सेल काउंटर रेखांकन हिस्टोग्राम के रूप में सेल की आबादी आँकड़े प्रदर्शित करता है. 2. गिनती के लिए एक एकल कोशिका सस्पेंशन की तैयारी राजाधिकार सेल काउंटर का उपयोग करने के लिए, कक्षों की एक एकल कक्ष निलंबन गिराए द्वारा शुरू, फॉस्फेट में खारा buffered. एमएल प्रति 10,000-500,000 कोशिकाओं के एक एकाग्रता के इष्टतम है. एक 1.5 एमएल microfuge ट्यूब पतला कोशिकाओं के 100 μL स्थानांतरण. 3. सेल राजदंड का उपयोग गिनता प्रदर्शन दबाव और पकड़े साधन के पीठ पर टॉगल करके राजाधिकार सेल काउंटर पर मुड़ें और स्क्रीन पर प्रकट निर्देशों के लिए प्रतीक्षा करें. जब संकेत दिया है, इलेक्ट्रोड संवेदन साधन के सामने की ओर का सामना करना पड़ पैनल के साथ राजाधिकार इकाई के अंत करने के लिए एक संवेदक देते हैं. राजाधिकार सेंसर एक सटीक ढाला नमूने चैम्बर के एक इलेक्ट्रॉनिक संवेदन क्षेत्र और एकीकृत सेल संवेदन इलेक्ट्रोड के साथ मिलकर बनता है. सेंसर उप माइक्रोन संकल्प सेल आकार भेदभाव करने के लिए, और उप picoliter संकल्प पर सेल की मात्रा बनाते हैं. अनुरूप सेंसर इंजीनियरिंग यह सुनिश्चित करता है कि बराबर नमूना संस्करणों गिना रहे हैं और सही आकार माप बना रहे हैं. एक बार सेंसर संलग्न, गिनती निम्नानुसार ऑन – स्क्रीन निर्देशों के अनुसार प्रक्रिया के प्रत्येक कदम प्रदर्शन: जब स्क्रीन पढ़ता है "नीचे सवार पकड़ो करने के लिए शुरू," सवार दबाना. स्क्रीन तो "सेंसर डूब." पढ़ा होगा डूब सेल निलंबन के समाधान में सेंसर और सवार रिलीज के लिए सेंसर में सेल निलंबन aspirate. सवार एक बिजली के संकेत के रूप में कार्य करता है और नमूना प्लस सेंसर में मृत मात्रा को आकर्षित करेगा. या जल्दी से आगे बढ़नेवाला की गति और सटीकता के रूप में यह pipetting के साथ करता है कोई फर्क नहीं पड़ता. यह प्रक्रिया कई सेकेंड ले जाएगा. जब तैयार है, साधन बीप होगा, और लोड नमूना "स्क्रीन पर प्रदर्शित किया जाएगा. एक बार नमूना सेंसर संवेदन क्षेत्र के माध्यम से तैयार की है सेल आकार और सेल की मात्रा का आकलन, microchannels के माध्यम से तो में भरी हुई है. एक बार नमूना के 50 μL गिना जाता है सेंसर साधन बताता है की गिनती बंद. गिनती के बाद पूरा हो गया है, साधन है स्क्रीन को पढ़ने के "पूरा गणना कृपया सेंसर हटाने और त्यागें." होगा प्रॉम्प्ट का पालन करें, और हटाने और सेंसर त्यागें. साधन तब अपनी स्क्रीन पर सेल आकार या व्यास का एक हिस्टोग्राम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एमएल प्रति एकाग्रता सेल प्रदर्शित करेगा. 4. डेटा विश्लेषण बाद गिनती पूरा हो गया है और हिस्टोग्राम उपकरण पर प्रदर्शित होता है, टॉगल बटन धकेलने के द्वारा फाटक लागू. "ऑटो gating" या "पिछले का उपयोग करें" या तो स्वचालित रूप से हिस्टोग्राम प्रोफ़ाइल पर आधारित गेट सेट करने के लिए, या पिछले गिनती से फाटकों का उपयोग करने का चयन करें. चयन के बावजूद, फाटकों मैन्युअल डेटा ठीक धुन करने के लिए ले जाया जा सकता है. टॉगल बटन को फिर से पुश करने के लिए छोड़ दिया फाटक का चयन करें और स्क्रॉल करने केफाटक के कदम के रूप में वांछित ggle. फिर टॉगल फिर प्रेस करने के लिए सही फाटक को सक्रिय करने और टॉगल स्क्रॉल करने के लिए सही फाटक जगह. फिर से क्लिक करें, एक नया सेल, एकाग्रता औसत सेल मात्रा और व्यास प्रदर्शित किया जाएगा. टॉगल भी दोनों ओर ले जाया जा सकता है प्रदर्शन के लिए तारीख के बीच स्विच, समय, सेल आकार का मतलब है, और सेल मात्रा मतलब है. 72 histograms साधन ही पर संग्रहीत किया जा सकता है. एक व्यक्तिगत कंप्यूटर के लिए डाटा अपलोड करने के लिए, डिस्प्ले स्क्रीन पर यूएसबी केबल बंदरगाह के माध्यम से साधन देते हैं. पीसी पर, राजाधिकार सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग पर डबल क्लिक करें सॉफ्टवेयर लांच तो "कनेक्ट" पर क्लिक करें. सब मायने रखता है स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर के लिए बंदरगाह होगा. राजाधिकार अनुप्रयोग सॉफ्टवेयर या तो मात्रा या व्यास में संस्कृति की जनसंख्या वितरण का ब्यौरा हिस्टोग्राम प्रदर्शित करता है. डाउनलोड की फ़ाइलें तब Microsoft Excel में, जहां कच्चे डेटा निर्दिष्ट सेल व्यास या सेल संस्करणों के डिब्बे में प्रदर्शित किया जाएगा करने के लिए निर्यात किया जा सकता है. 5. प्रतिनिधि परिणाम उन्नीस विभिन्न सेल लाइनों की गणना के लिए तैयार थे और सैद्धांतिक शुरू सांद्रता कल्टर काउंटर का उपयोग करके निर्धारित किया गया है. ये सेल निलंबन तो आगे थे सैद्धांतिक सेल सांद्रता में सेल निलंबन प्राप्त पतला है. राजाधिकार सेल काउंटर तब सेल सांद्रता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. चित्रा 1 से पता चलता है 5 dilutions कि सैद्धांतिक कक्ष एकाग्रता के साथ साथ 5 प्रतिनिधि सेल लाइनों के लिए मापा गया. linearity के उच्च डिग्री के रूप में R2 मूल्यों ने संकेत दिया दर्शाता है, राजाधिकार गिनती सेल एक विस्तृत रैखिक ऑपरेटिंग रेंज भर में परीक्षण किया है, लाइनों के लिए एक विश्वसनीय तरीका है कि. राजाधिकार गिनती के समग्र रिश्तेदार सटीकता चित्रा 2, जिसमें राजाधिकार गिनती से प्राप्त आंकड़ों कल्टर गिनती से प्राप्त की गिनती के साथ तुलना कर रहे हैं में प्रदर्शन किया है. राजाधिकार कोशिकाओं की गिनती का लॉग कल्टर की गिनती के लॉग खिलाफ प्लॉट किए जाते है, और पता चलता है कि सभी सेल परीक्षण लाइनों के पार, राजाधिकार मायने रखता है कल्टर मायने रखता मैच है. 19 सेल लाइनों की गणना Z2 कल्टर काउंटर, राजाधिकार सेल काउंटर, Vi सेल या अनगिनत प्रणाली जैसे एक स्वचालित दृष्टि आधारित काउंटर, और एक hemocytemeter का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. गिनता निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया, एक ही सेल शुरू निलंबन और समान dilutions का उपयोग. परिणाम 3 चित्र में दिखाया है कि सेल द्वारा मापा सांद्रता उच्च linearity के साथ मिलकर सैद्धांतिक सेल सांद्रता मैच राजाधिकार गिनती प्रदर्शित करता है. प्रतिशत भिन्नता के गुणांक, या CV, प्रत्येक गिनती प्रणाली के लिए प्रत्येक कोशिका लाइन के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए गणना की गई. चित्रा 4 19 सेल एकाग्रता और विधि की गिनती के लिए सम्मान के साथ सेल लाइनों पर औसत% सार – वृत्त (सीवी) से पता चलता है. परिचालन सीमा के भीतर, राजाधिकार सेल काउंटर दृष्टि आधारित hemocytometer गिनती की तुलना में अधिक सटीक है, छोटे मानक विचलन और बदलाव की छोटी औसत गुणांक प्रदर्शित. राजाधिकार गिनती hemocytometry की तुलना में दस गुना तेजी से और भी अन्य स्वचालित काउंटर की तुलना में तेजी है. चित्रा 5, SF9, MCF7, और HEK293 कोशिकाओं में इस वीडियो में वर्णित विधियों का उपयोग कर गिना रहे थे. औसत सेल एकाग्रता को मापने के लिए आवश्यक समय दर्ज की गई थी. नोट है कि hemocytometry केवल एक बार नमूना प्रति प्रदर्शन किया था. राजाधिकार सेल आकार के आधार पर माप बनाता है. इस प्रकार सेलुलर आकारिकी में किसी भी परिवर्तन हिस्टोग्राम में कब्जा किया जा सकता है. स्वस्थ संस्कृतियों एक अच्छा घंटी आकार गाऊसी वितरण प्रदर्शित करते हैं, जबकि अस्वस्थ कोशिकाओं, lyse, और हिस्टोग्राम में एक बाईं करने के लिए पाली (6 चित्रा, बाईं पैनल) के कारण. इसी तरह, जब 50% मृत कोशिकाओं की आबादी 50% की जीवित कोशिकाओं के साथ मिलाया गया, हिस्टोग्राम पाली (6 चित्रा, सही पैनल) मनाया गया.

Discussion

राजाधिकार सेल काउंटर की गिनती अन्य तरीकों से परिणाम के लिए प्रदर्शन की तुलना, हम निष्कर्ष है कि इस नए हाथ, स्वचालित सेल काउंटर पर एक विस्तृत रेंज ऑपरेटिंग, तेज, सटीक और विश्वसनीय सेल मायने रखता है उद्धार. राजाधिकार गिनती की कार्यक्षमता सटीक इंजीनियर सेंसर टिप और परिष्कृत गिनती कल्टर सिद्धांत पर आधारित इंस्ट्रूमेंटेशन में एम्बेडेड प्रौद्योगिकी का एक परिणाम है. प्रदर्शन गुणवत्ता की गति को बढ़ाने के लिए और सेल आधारित assays के reproducibility में सुधार के लिए विधि के रूप में गिनती राजाधिकार पता चलता है. हाथ स्वरूप सेल संस्कृति हुड पर त्वरित क्लांति मुक्त गिनती सही अनुमति देता है.

Materials

Material Name	Company	Catalogue Number	Comment
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 40 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20040
Scepter 2.0 Handheld Automated Cell Counter with 60 μm Scepter Sensors	EMD Millipore	PHCC20060
Scepter Sensors, 60 μm	EMD Millipore	PHCC60050	50 Pack of sensors
Scepter Sensors, 40 μm	EMD Millipore	PHCC40050	50 Pack of sensors
Universal Power Adapter	EMD Millipore	PHCCPOWER
Scepter O-Ring Kit	EMD Millipore	PHCCOCLIP	2 O-rings and one filter cover