In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.
Il topo adulto cellule staminali della retina (RSC) è una rara cellula quiescente trovati all'interno dell'epitelio ciliare (CE) dell'occhio dei mammiferi 1,2,3. La marcatura CE è costituito da strati interni e pigmentate non pigmentate cellula esterna, e le colonie clonale RSC che nascono da una singola cellula pigmentata dalla CE sono costituiti da due cellule pigmentate e non pigmentate, che possono essere differenziati per formare tutte le tipi di cellule della retina neurale e la RPE. Vi è una certa polemica sul fatto che tutte le cellule all'interno delle sfere contengono tutti almeno alcuni pigmenti 4; ma le cellule sono ancora in grado di formare i diversi tipi di cellule trovati all'interno della retina neurale 1-3. In alcune specie, come gli anfibi e pesci, i loro occhi sono in grado di rigenerazione dopo una lesione 5, tuttavia, l'occhio dei mammiferi non mostra tali proprietà rigenerative. Cerchiamo di identificare le cellule staminali in vivo e per capire i meccanismi che mantengono le cellule staminali della retina dei mammiferi quiescente 6-8, anche dopo l'infortunio così come servirsi di esse come una potenziale fonte di cellule per riparare i modelli fisici o genetici di lesioni agli occhi attraverso il trapianto di 9-12. Qui si descrive come isolare le cellule ciliari epiteliali dall'occhio del mouse e farle crescere in coltura in modo da formare la retina sfere clonale di cellule staminali. Poiché non ci sono marcatori conosciuti delle cellule staminali in vivo, queste sfere sono l'unico modo conosciuto per identificare in modo prospettico la popolazione di cellule staminali all'interno del epitelio ciliare dell'occhio.
Questo protocollo descrive come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare del mouse occhio 1-3. La metodologia per isolare le strisce di epitelio ciliare può variare, tuttavia gli enzimi e la metodologia per il raggiungimento di una singola cella di sospensione sono stati ottimizzati in questo protocollo. E 'anche importante che le strisce di epitelio ciliare che sono stati isolati non contengono grandi quantità di RPE o di cornea da quando questi sembrano avere un impatto negativo sul numero totale delle sfere che possono essere isolate da ogni occhio. Inoltre, il siero senza mezzi di comunicazione che facciamo che è stato originariamente formulato per il cervello neurosfere 13, è l'ideale per la coltivazione di cellule staminali della retina sfere. Si dovrebbe anche fare in modo che le cellule non sono disturbati dopo che sono stati placcati e posti nell'incubatrice in modo che le sfere in crescita non aggregato insieme 14.
Una volta che le cellule staminali della retina hanno formato sfere clonale, possono essere calcolate per ottenere un numero potenziale di cellule staminali per occhio. Le sfere allora può quindi essere dissociato in cellule singole e diversi passaggi per accertare le capacità di auto-rinnovamento o differenziate in diversi tipi di cellule della retina neurale e RPE utilizzando diverse combinazioni di fattori di crescita e / o proteine.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Laura Clarke per la sua preziosa assistenza. Questo lavoro è supportato da NCE: Rete delle cellule staminali, CIHR e NIH.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Stemi 2000 Microscope | Zeiss | |||
Cold Light Source | Zeiss | KL1500 | dual arm optic light | |
Curved Mini Vannas scissors | FST | 15000-10 | ||
Angled Vannas scissors | FST | 15005-08 | ||
#7 Dumont forceps | FST | 11272-30 | non-serrated | |
#5 Dumont forceps | FST | 11251-10 | straight | |
Fine forceps | FST | 11051-10 | serrated curved | |
#3 Scalpel handle | Almedic | 2586-M36-10 | ||
#10 Scalpel blades | Almedic | 2580-M90-10 | ||
Hot Bead Sterilizer | FST | 18000-45 | ||
Dispase | VWR/BD | CACB354235 | ||
Trypsin | Sigma | T1005 | ||
Hyaluronidase | Sigma | H6254 | ||
Kynurenic Acid | Sigma | K3375 | 1000 IU | |
Trypsin Inhibitor | Roche | 10109878001 | ||
35 mm dishes | VWR/Nunc | CA354235 | ||
24-well plate | VWR/Nunc | CA73521-004 | ||
Cotton-plugged pipettes | VWR | 14672-400 | fire-polish | |
14 mL Tubes | Falcon | 352057 | Polystyrene | |
Serum-free Media | Ref# 13 for formulation | |||
FGF2 | Sigma | F0291 | ||
Heparin | Sigma | H3149 | 100 IU |