のUV -誘発複製中間体の可視化 E.大腸菌二次元アガロースゲル分析を用いた
Summary
我々は、2次元アガロースゲル分析は、UV照射後に発生する複製の中間体の構造を識別するために使用できるようにするための手順を示します。
Abstract
DNA損傷の存在下で不正確な複製は、すべての細胞型で観察し、広く直接ヒトの癌の開発に関連付けられていると信じられている細胞の再配列と特異的変異の大部分を担当しています。このような紫外線照射によって誘導されるようなDNA損傷は、著しく正確にゲノムテンプレートを複製する複製の能力を損なう。遺伝子産物の数は、複製が鋳型にDNA損傷を検出すると、必要とされるが確認されている。しかし、残りの課題は、これらのタンパク質は、複製中に病変の処理方法を決定することでした<em> in vivoで</em>。モデル系として大腸菌を用いて、我々は、2次元アガロースゲル分析がreplicatingプラスミドに生じた構造的な中間体を識別するために使用できる手順を説明します。<em> in vivoで</em>以下の紫外線誘発DNA損傷。この手順は、紫外線による損傷によってブロックされた複製フォークは、RecAタンパク質とRecFの経路に関連付けられているいくつかの遺伝子産物によって安定化される一時的な反転を受けることを示すために使用されています。技術は、これらの複製の中間体は、ヌクレオチド除去修復と複製が再開による病変の除去と相関する時間まで維持されていることを示している。
Protocol
Discussion
紫外線による損傷の存在下および非存在下で野生型の細胞から得られた典型的な結果を図1に示されています。細胞が急速に指数増殖期で成長しているときに損傷がない場合には、合計プラスミドDNAの〜1％がYの円弧で見つけることができます。ブロックされた複製フォークが損傷部位に蓄積するように照射後、Y字型の分子の一過性増加が観察される。 X字型の複製中間体はまた、一時的に蓄?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究室での作業は、NIGMS – NIHから国立科学財団とAREA助成R15GM86839からキャリア賞MCB0551798によってサポートされています。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
| 15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
| Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
| 0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
| PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
| Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
| Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
| Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |
Riferimenti
- Davis, B. D. The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin. Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).
- Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli. Science. 299, 1064-1067 (2003).
- Friedman, K. L., Brewer, B. J. Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).
- Spivak, G., Hanawalt, P. C. Determination of damage and repair in specific DNA sequences. METHODS: A Companion to Methods in Enzymology. 7, 147-161 (1995).
- Sambrook, J., Russell, D. W. . Molecular Cloning – A laboratory manual. , (2001).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli. J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).
- Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli. Genetica. 166, 1631-1640 (2004).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli. J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).
- Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest. J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).
- Chow, K. H., Courcelle, J. RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli. Radiat Res. 168, 499-506 (2007).
- Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions. Mutat Res. 645, 19-26 (2008).
