We presenteren een procedure waarbij twee-dimensionale agarose-gel analyse kan worden gebruikt om de structuur van de replicatie tussenproducten die optreden na UV-straling te identificeren.
Onnauwkeurige replicatie in de aanwezigheid van DNA-schade is verantwoordelijk voor het merendeel van de cellulaire herschikkingen en mutagenese waargenomen in alle celtypes en wordt algemeen aangenomen dat direct geassocieerd met de ontwikkeling van kanker bij de mens. DNA-schade, zoals die veroorzaakt door UV-straling, vermindert sterk het vermogen van replicatie naar de genomische template nauwkeurig te dupliceren. Een aantal van gen-producten zijn geïdentificeerd die nodig zijn voor het replicatie ontmoetingen DNA laesies in de sjabloon. Er is echter een resterende uitdaging is hoe deze eiwitten te bepalen laesies tijdens replicatie<em> In vivo</em>. Met behulp van Escherichia coli als een modelsysteem, beschrijven we een procedure waarin twee-dimensionale agarose-gel-analyse kan worden gebruikt om de structurele tussenproducten die ontstaan bij replicerende plasmiden te identificeren<em> In vivo</em> Na UV-geïnduceerde DNA-schade. Deze procedure is gebruikt om aan te tonen dat de replicatie vorken geblokkeerd door UV-geïnduceerde schade een tijdelijke omkering die wordt gestabiliseerd door RecA en verschillende genproducten worden geassocieerd met het RecF pad ondergaan. De techniek laat zien dat deze replicatie tussenproducten worden gehandhaafd tot een moment dat correleert met de verwijdering van de letsels door nucleotide excisie reparatie en replicatie hervat.
Typische resultaten van wild-type cellen in de aanwezigheid en afwezigheid van UV-geïnduceerde schade zijn weergegeven in figuur 1. Bij het ontbreken van schade, kan ~ 1% van de totale plasmide DNA te vinden in de Y-boog wanneer de cellen groeien snel in exponentiële fase. Na de bestraling, is een tijdelijke toename van Y-vormige moleculen waargenomen als geblokkeerd replicatie vorken zich ophopen aan beschadigd sites. De X-vormige replicatie tussenproducten ook tijdelijk ophopen en blijven bestaan totdat er een…
The authors have nothing to disclose.
Werken in ons lab wordt ondersteund door LOOPBAAN award MCB0551798 van de National Science Foundation en het gebied te verlenen R15GM86839 van de NIGMS-NIH.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
An example of the Southern analysis of the 2D gel probed | GE | G15T8 | Yellow Lighting | |
15 μwatt germicidal lamp | Sylvania | F20T12/GO | UV Lamp | |
Blak-Ray UV Intensity Meter 254nm | Daigger | EF28195T | UVC photometer | |
0.025 μm pore disks | Whatman | VSWP04700 | Floating dialysis disks | |
PvuII | Fermentas | ER0632 | Restriction Endonuclease | |
Nick-translation kit | Roche Diagnostics | 976776 | To make 32P-labeled probe | |
Blotting Paper | Whatman | 3030-704 | For Southern transfer | |
Nylon membrane | GE Healthcare | RPN203S | For Southern transfer |