Питатель-Free адаптации, культуры и пассажи клеток человека IPS использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среднего

Summary

Следующий протокол предусматривает обучение для адаптации человека индуцированных плюрипотентных стволовых (IPS) Клетки для фидерных без культуры с помощью полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды (КСР-FF). Как только адаптированные, инструкции для постоянного обслуживания также обеспечены.

Abstract

Открытие в 2006 году, что человеческие и мышиных фибробластов может быть перепрограммирован для получения плюрипотентных клетках ^1-3 с качествами, удивительно похожи на эмбриональные стволовые клетки создал новую ценную источником плюрипотентных клеток для открытия новых лекарств, клеточная терапия, и фундаментальных исследований.

GIBCO СМИ и реагенты были на переднем крае плюрипотентных исследований стволовых клеток в течение многих лет. Нокаут DMEM дополнен Нокаут сыворотки Замена средств по выбору для эмбрионального роста стволовых клеток, а теперь плюрипотентных клеточных культур ^3-9. Это золотой стандарт системы средств массовой информации теперь может быть использован для подачи без культуры с добавлением Knockout SR Коктейль фактор роста.

Традиционные человека плюрипотентных ES и методов клеточной культуры требует использования мыши или человека слоев фибробластов подачи или подачи с кондиционером среды. Эти культуры методы трудоемки, трудно масштабировать и трудно поддерживать бедра клетки недифференцированной из-за неопределенных условиях. Invitrogen разработала Нокаут SR фактор роста коктейль, чтобы позволить Вам легко перенести ваши бедра культур ячейки подачи без сохраняя при этом ваше использование Нокаут SR.

Protocol

Примечание: Для поддержания стерильных условиях культуры, все процедуры в данном протоколе проводятся с использованием стерильной лабораторной практики и проводится в соответствии ламинарном боксе. Перед началом, убедитесь, что любые средства массовой информации находится в равновесии до 37 ° С и надлежащим образом в газовых камерах. Подготовка Geltrex покрытием Блюда культуры Примечание: см. приложение для использования CELLstart покрытием блюда культуры Оттепель одна трубка Geltrex (1 мл) медленно при температуре 2-8 ° С и разбавленных 1:100 она в 99 мл Нокаут D-MEM/F-12. Смешайте раствор нежно. Примечание: Некоторые линий плюрипотентных клеток могут требовать различные разведения Geltrex для оптимального роста. См. приложение для альтернативного разведения. Обложка всей поверхности каждой культуры блюдо с решением Geltrex (1 мл на 35-мм блюдо, 1,5 мл для 60-мм блюдо). Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения высыхания и инкубировать блюда в течение 1 часа при температуре 37 ° C. Примечание: На данном этапе вы можете хранить Geltrex покрытием блюда культуры при 4 ° С в течение 1 месяца. Печать каждое блюдо с парафильмом для предотвращения Geltrex от высыхания. Перед началом использования, передачи Geltrex покрытием блюда ламинарном боксе и позволит им, чтобы уравновесить до комнатной температуры (около 1 часа). Подготовка Полное питатель-Free SR KnockOut среднего Для приготовления 1 мл 10 мкг / мл Базовое решение FGF, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Алиготе решение и хранить при температуре -20 ° С до 6 месяцев. Основные FGF 10 мкг D-PBS 990 мкл 10% BSA 10 мкл Примечание: BSA может быть заменен или HSA Нокаут SR на той же концентрации. Для подготовки 50 мл 2 мг / мл Dispase решение, асептически смесь компонентов, перечисленных ниже. Фильтры стерилизации раствора и хранить при 4 ° С в течение 2 недель. Dispase 100 мг D-PBS 50 мл Для подготовки 100 мл полной SR KnockOut питатель-Free (KSR-FF) среду асептически объединить компоненты, перечисленные в таблице ниже. Компонент Концентрация сток Конечная концентрация Объем Нокаут DMEM/F12 (кат. нет. 12660-012) – 1X 76,8 мл GlutaMAX-I (кат. № 35050-061) 200 мМ 2 мМ 1 мл KnockOut SR (кат. нет. 10828-028) – 20% 20 мл KnockOut SR-GFC (кат. нет. A10580-01) 50X 1X 2 мл bFGF (кат. нет. PHG0024) 10 мкг / мл 20 нг / мл 200 мкл Вы можете хранить KSR-FF среде при температуре 2-8 ° С не более одной недели. Перед предварительно уравновешивающая полной среде с температурой и газами, асептически добавить необходимый объем 2 меркаптоэтанол (55 мМ фондовом концентрация) для 0,1 ммоль конечной концентрации. Например, чтобы подготовить 100 мл KSR-FF средний добавить 182 мкл 55 мМ 2-меркаптоэтанол (1:550 разведение) Кроме того, 2-меркаптоэтанол могут быть добавлены к 1X завершены средние и хранить при температуре 2-8 ° С в течение до одной недели. Адаптация к iPSCs KSR-FF среднего Перед началом, предварительно уравновешиваются ваш Geltrex покрытием блюд до комнатной температуры в капюшон. Культура iPSCs на клетки MEF подачи, пока они не 70-80% вырожденная. Пожалуйста, обратитесь к GIBCO мышиных эмбриональных фибробластов пособие для MEF протоколы на основе культуры. </LI> Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется. Аспирируйте среды от культуры блюд, а также добавить соответствующее количество Dispase решение. Инкубируйте блюда при температуре 37 ° С в течение 3-5 минут. Аспирируйте Dispase решения от каждой культуры судна и смыть клетки MEF подачи осторожно D-PBS (от 2 до 3 раза). Добавить соответствующей суммы полной среды SR KnockOut к каждой культуры судна. Используйте скребок ячейки или 5 мл пипетки, чтобы мягко очистить клетки с поверхности сосуда для культивирования. Примечание: см. Приложение альтернативные протоколы адаптации трудно адаптироваться плюрипотентных клеточных линий, Сбор клеточной суспензии из каждой культуры блюдо на отдельные 15 мл конические пробирки. Промыть каждую культуру сосуд с соответствующим количеством полной среде SR нокаутом, и добавить D-PBS промыть среды в 15 мл конические пробирки, содержащие суспензии клеток. Будьте осторожны, чтобы не сломать ячейки сгустки в одиночных камерах Центрифуга 15 мл конические пробирки при 200 мкг в течение 5 минут, чтобы гранулы iPSCs. Аспирируйте супернатант из IPSC гранул. Ресуспендируют пеллет в соответствующее количество KSR-FF среды согласно коэффициенту распределения (табл. 1). Не разбивайте ячейки сгустки до меньшего размера, потому что меньшие сгустки не придают скважины на поверхность. Примечание: Мы рекомендуем разделить соотношении 1:2 в течение первых 3 места после iPSCs были пассировали непосредственно из культуральной среды IPSC MEF для KSR-FF среды. Как правило, раскол соотношение между 1:3 и 1:05 уместна, но пассажи в 1:02 обеспечивает более высокую плотность клеток, необходимых при адаптации в фидерных свободной культуры. До покрытия iPSCs на Geltrex покрытием блюда, аспирации остаточного решение Geltrex из предварительно покрытых блюдо, и постепенно добавить соответствующее количество суспензии клеток в каждой культуре блюдо. Обратите внимание: не полоскать блюд до обшивки. Перемещение культуры блюдо вперед и назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки по всей поверхности блюда. Аккуратно культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфере от 4 до 6% СО 2 в воздухе. Замените провел среде с KSR-FF с каждым днем. Пассирования клеток человека плюрипотентных использованием KSR-FF Соблюдайте человека iPSCs растет в полной KSR-FF под микроскопом, чтобы подтвердить, что клетки 70-80% сливной и готова к пересеву. См. Рисунок 1. Примечание: Если колонии становятся слишком плотная или слишком большим, увеличилась дифференциация происходит. Вырежьте и удалите все дифференцированные IPSC колонии до пассажей культуры. Предварительно теплой необходимый объем Dispase в 37 ° С водяной бане. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется. Предварительно равновесие необходимый объем KSR-FF в 37 ° С водяной бане for15 мин. См. Таблицу 1 ниже для деталей относительно объемов требуется. Аспирируйте провел среды из сосуда для культивирования с помощью пипетки, и промойте клетки дважды с D-PBS. Аккуратно добавить подогретого Dispase решение культуры судна (например, 1 мл раствора на Dispase 60-мм культуры блюдо). Swirl культуры судна, чтобы покрыть всю поверхность клетки. Инкубируйте культуру судна при температуре 37 ° С в течение 3 минут. Удалить сосуд из инкубатора, аспирация Dispase решение, и осторожно мыть клетки с D-PBS. Аккуратно очистить клетки с поверхности культуры блюдо, используя сотовый скребок и передачи клеткам стерильные 15 мл центрифужную пробирку. Промыть культуры блюдо дважды с KSR-FF, мягко "распыления от" любой клетки, которые не отделены. Бассейн промыть среды с клетками в 15 мл трубки. Центрифуга трубке при 200 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре до гранул клеток. Тщательно аспирата супернатант, не нарушая осадок клеток и отбросить его. Аккуратно вылить содержимое трубки, чтобы полностью вытеснить клеточный осадок из трубки вниз. Аккуратно ресуспендирования клеток в предварительно уравновешенную KSR-FF использованием 5 мл серологические пипетки. Не растирают. Примечание: очень важно, на шаг, чтобы аккуратно ресуспендируют клетки без применения силы, чтобы избежать повреждений. Передача клетки свежих 60-мм Geltrex покрытием блюдо в нужном Коэффициент распределения и двигаться культуры блюдо вперед-назад и из стороны в сторону несколько раз, чтобы разогнать клетки через ее поверхность. Место культуры блюдо в 37 ° C инкубаторе с влажной атмосфереОт 4 до 6% СО 2 в воздухе. На следующий день, мягко заменить провел среде с KSR-FF, чтобы удалить ячейку мусора. Замените провел среда повседневной после этого. Соблюдайте плюрипотентных клетках ежедневно и прохождение их по мере необходимости (примерно раз в 4-5 дней). Пассирования рекомендуется, когда клетки достигают 70-80% слияния. Для КП криоконсервации клеток и оттаивания, обратитесь к нашему протокол под названием "Cryopreserving и восстановление клеток человека плюрипотентных использованием Полное KnockOut сыворотки питатель-Free Замена Medium". Ожидаемые результаты Рисунок 1. Изображение фазового контраста ниже показаны iPSCs выросли на Geltrex покрытием культуры блюда с использованием полного KnockOut сыворотки питатель-Free Замена среды. IPSCs выставку морфологии похож на ЭСК, характеризуется большими ядрами и скудной цитоплазмой. (40-кратном увеличении) Компонент 35 блюд Блюдо 60 мм Блюдо 100 мм Полное KnockOut SR среда 2 мл 4 мл 10 мл Решение Geltrex 1 мл 1,5 мл 4-5 мл Dispase 0,5 мл 1 мл 3-4 мл D-PBS для полоскания 2 мл 4 мл 10 мл Таблица 1. Рекомендуемые объемы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть приложение .

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Knockout DMEM/F12			Cat. no. 12660-012	Note: see appendix for the use of alternative DMEM products
GlutaMAX-I			Cat. No. 35050-061
KnockOut Serum Replacement			KnockOut SR, Cat. no. 10828-028
KnockOut Serum Replacement Growth Factor Cocktail			KnockOut SR-GFC, Cat. no. A10580-01
FGF-basic, human recombinant protein, 10 μg			bFGF, Cat. no. PHG0024	Note: see appendix for alternative bFGF pack sizes.
2-Mercaptoethanol			Cat. no. 21985-023
Dispase			Cat. no. 17105-041	Note: see appendix for alternative passaging methods.
Geltrex hESC-Qualified Reduced Growth Factor Basement Matrix, 1 mL			Cat. no. A10480-01
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) without calcium and magnesium			Cat. no. 14190-144
Sterile Tissue Culture Hood
Incubator set at 37°C
Pipette-Aid
Water Bath set at 37°C
Sterile serological pipettes (5 mL, 10 mL)
Centrifuge
15 mL centrifuge tubes
60mm Tissue Culture treated dishes