Midgastrula 스테이지 Drosophila의 태아에서 문화의 연결 준비

Summary

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.

Abstract

이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화를 만들기위한 절차를 설명합니다. 표백제를 사용하는 배아하고 dechorionation를 수집하기 위해 방법은 증명하고 있습니다. 입 흡입 튜브에 부착된 유리 pipet을 사용하여, 우리는 하나의 배아에서 세포의 제거를 보여줍니다. uncoated 유리 coverslip에 대한 매체의 작은 (5 L) 드롭으로 각 embyro에서 세포를 분산하는 방법을 시연합니다. 도금 후 1 시간에 현미경을 통해보기 원하는 세포 밀도를 보여줍니다. 정의 매체 자라면 생존 세포의 대부분은 12-24시간로 neuritic 프로세스를 확장하기 전에 문화를 한 번 이상 나누어 neuroblasts 있습니다. 현미경을 통해 볼 수 neurite 가지의 수준을 보여줍니다과 체외에서 이일에 건강한 문화의 예상 분기. 문화가 22-24 ° C.에서 5 % CO ₂ 배양기에서 정의된 매체를 기반으로 간단한 중탄산염에서 재배 Neuritic 프로세스는 문화의 첫 번째 주 동안 정교한 계속하고 그들은 종종 기능 시냅스 연결을 형성 인접 세포에서 neurites과 접촉을 때. 이러한 문화의 뉴런 전압 – 게이 티드 나트륨, 칼슘, 그리고 칼륨 채널을 표현하고 전기 고르기가 있습니다. 이 문화 시스템의 연결을 차별화, 흥분, 그리고 버렸네 형성 / 기능을 조절 분자 유전과 환경 요인을 공부하는 데 유용합니다.

Protocol

I. Drosophila의 배아 컬렉션 달걀 수집 번호판을 준비 8g의 한천과 함께 삶아 200 ML DH 2 O 50 쿨 ° C 2 ML EtOH 2 ML 초산 추가 35mm 플라스틱 배양 접시, 정상에 따르다 4 쿨 공기 꽉 컨테이너에 가게 ° C 약 80 접시를 만듭니다 효모 붙여넣기 준비 붙여넣기 양식 물에 Fleishmans 적극적인 제빵 효모를 디졸브 누룩을 죽일 20-…

Discussion

midgastrula 스테이지 배아에서 준비 Drosophila 문화에서 뉴런은 체외에서 분화하기 전에 분할 많은 중 neuroblast의 엽 성의 전구 물질에서 발생. 이 시스템의 연결을 따라서 개발의 매우 초기 단계 (로보어 외., 2003)에서 중요한 유전과 환경 요인의 탐험에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 간단한 정의 매체 성장 뉴런도 (; 리 O 다우드, 1999 O 다우드, 1995) 기능 시냅스 연결을 형성 전기 고르기 뉴런으로 차별화하는 …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Drosophila melanogaster	Animal			Fruit flies
Transferrin	Reagent	Sigma	T-1147	100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin		Sigma	I-6634	200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine		Sigma	P-5780	100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium		Sigma	S-5261	100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone		Sigma	P-6149	100x Stock: 2 ug/ml 1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle 2. Add 49 ml ddH2O 3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O 4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate) 5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1	Medium			To 10 mls of DMEM add from stocks: 100 ul Transferrin, 100 ul Putrescine, 100 ul Selenium, 100 ul Progesterone, 50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips		Bellco Biological Glassware	1943-00012	Low lead glass, autoclaved.
Paper filter		Whatman	#1
10cc syringe	Tool

The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.