이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화의 준비를 보여줍니다. 라이브 문화의 전망 중탄산염 기반 정의 매체 성장 2 일 후에 도금과 차별화된 뉴런 후 세포를 1 시간 보여줍니다. 뉴런은 전기 고르기하고 시냅스 연결을 형성합니다.
Abstract
이 동영상은 midgastrula 무대 Drosophila의 배아에서 기본의 연결을 문화를 만들기위한 절차를 설명합니다. 표백제를 사용하는 배아하고 dechorionation를 수집하기 위해 방법은 증명하고 있습니다. 입 흡입 튜브에 부착된 유리 pipet을 사용하여, 우리는 하나의 배아에서 세포의 제거를 보여줍니다. uncoated 유리 coverslip에 대한 매체의 작은 (5 L) 드롭으로 각 embyro에서 세포를 분산하는 방법을 시연합니다. 도금 후 1 시간에 현미경을 통해보기 원하는 세포 밀도를 보여줍니다. 정의 매체 자라면 생존 세포의 대부분은 12-24시간로 neuritic 프로세스를 확장하기 전에 문화를 한 번 이상 나누어 neuroblasts 있습니다. 현미경을 통해 볼 수 neurite 가지의 수준을 보여줍니다과 체외에서 이일에 건강한 문화의 예상 분기. 문화가 22-24 ° C.에서 5 % CO 2 배양기에서 정의된 매체를 기반으로 간단한 중탄산염에서 재배 Neuritic 프로세스는 문화의 첫 번째 주 동안 정교한 계속하고 그들은 종종 기능 시냅스 연결을 형성 인접 세포에서 neurites과 접촉을 때. 이러한 문화의 뉴런 전압 – 게이 티드 나트륨, 칼슘, 그리고 칼륨 채널을 표현하고 전기 고르기가 있습니다. 이 문화 시스템의 연결을 차별화, 흥분, 그리고 버렸네 형성 / 기능을 조절 분자 유전과 환경 요인을 공부하는 데 유용합니다.
Protocol
I. Drosophila의 배아 컬렉션 달걀 수집 번호판을 준비 8g의 한천과 함께 삶아 200 ML DH 2 O 50 쿨 ° C 2 ML EtOH 2 ML 초산 추가 35mm 플라스틱 배양 접시, 정상에 따르다 4 쿨 공기 꽉 컨테이너에 가게 ° C 약 80 접시를 만듭니다 효모 붙여넣기 준비 붙여넣기 양식 물에 Fleishmans 적극적인 제빵 효모를 디졸브 누룩을 죽일 20-…
Discussion
midgastrula 스테이지 배아에서 준비 Drosophila 문화에서 뉴런은 체외에서 분화하기 전에 분할 많은 중 neuroblast의 엽 성의 전구 물질에서 발생. 이 시스템의 연결을 따라서 개발의 매우 초기 단계 (로보어 외., 2003)에서 중요한 유전과 환경 요인의 탐험에 대한 독특한 기회를 제공합니다. 우리는 간단한 정의 매체 성장 뉴런도 (; 리 O 다우드, 1999 O 다우드, 1995) 기능 시냅스 연결을 형성 전기 고르기 뉴런으로 차별화하는 …
Acknowledgements
이 작품은 DKOD에 NIH 부여 NS27501에 의해 지원되었다. HHMI 교수 부여에서 DKOD이 작업에 대한 추가 지원합니다.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
Drosophila melanogaster
Animal
Fruit flies
Transferrin
Reagent
Sigma
T-1147
100x Stock: 10 mg/ml in water. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Insulin
Sigma
I-6634
200x Stock: 10 mg/ml in 0.05N HCl. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 120 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C.
Putrescine
Sigma
P-5780
100x Stock: 10 mM in ddH2O. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20 C
Selenium
Sigma
S-5261
100x Stock: 3 uM in ddH2O. Put 0.0051 g Selenium in a 15 ml tube labeled A (3 mM stock). Add 10 ml of sterile water. Take 10 ul from Tube A to Tube B with 10 ml ddH2O (3 uM stock). Filter Tube B through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate). Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
Progesterone
Sigma
P-6149
100x Stock: 2 ug/ml
1. Add 1ml of 100% EtOH to 0.001 g Progesterone bottle
2. Add 49 ml ddH2O
3. Transfer 1 ml of this to second tube with 9 ml ddH2O
4. Filter through 0.2 um syringe filter (cellulose acetate)
5. Store in 220 ul aliquots (for 20 ml DMEM) at -20C
DDM1
Medium
To 10 mls of DMEM add from stocks:
100 ul Transferrin,
100 ul Putrescine,
100 ul Selenium,
100 ul Progesterone,
50 ul Insulin
Petri dishes
Cover-slips
Bellco Biological Glassware
1943-00012
Low lead glass, autoclaved.
Paper filter
Whatman
#1
10cc syringe
Tool
The cultures made in this media must be maintained in a 5% CO2 incubator at about 22-24°C. We use a standard mammalian tissue culture incubator placed in a cold room and heated to 23°C. Always used autoclaved filtered water and make in containers that are reserved for media and supplements only. Never put a pH meter or stir bar used for other purposes in media.
Sicaeros, B., O’Dowd, D. K. Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (5), e226, doi:10.3791/226 (2007).