Metoder för experimentell manipulationer efter Optic Nerve transection i Mammalian CNS
Summary
Synnerven transection är en allmänt använd modell av vuxna CNS-skada. Denna modell är idealisk för att utföra ett antal experimentella manipulationer som inriktar sig på näthinnan globalt eller direkt riktade till den skadade neuronala befolkning retinal ganglion celler.
Abstract
Retinal ganglion celler (RGC: er) är CNS-nervceller som utdata visuell information från näthinnan till hjärnan via synnerven. Synnerven kan nås inom bana i ögat och helt transected (axotomized), skära av axoner av hela RGC befolkningen. Synnerven transection är en reproducerbar modell av apoptotiska nervcellsdöd i vuxna CNS 1-4. Denna modell är särskilt attraktiva eftersom glaskroppen kammare i ögat fungerar som en kapsel för drug delivery till näthinnan, som möjliggör experimentella manipulationer via intraokulära injektioner. Spridning av kemikalier genom glaskroppen vätska ser till att de agerar på hela RGC befolkningen. Virala vektorer, plasmider eller korta interfererande RNA (siRNA) kan även levereras till glaskroppen kammaren för att infektera eller transfektera näthinnans celler 5-12. Den höga tropism av Adeno-associerade virus (AAV) vektorer är fördelaktigt att rikta RGC: er, med en infektion takt närmar sig 90% av cellerna i närheten av injektionsstället 6, 7, 13-15. Dessutom kan RGC: er vara selektivt transfekterade genom att tillämpa siRNA, plasmider eller virala vektorer på den avskurna ändan av synnerven 16-19 eller injicera vektorer i sitt mål den överlägsna colliculi 10. Detta gör det möjligt för forskare att studera apoptotiska mekanismer i den skadade neuronala befolkningen utan störande effekter på andra åskådare nervceller eller omgivande Glia. RGC apoptos har en karakteristisk tid-kurs där celldöd är försenad 3-4 dagar postaxotomy, varefter cellerna snabbt urarta. Detta ger ett fönster för experimentella manipulationer som riktas mot involverade i apoptos. Manipulationer som inriktas direkt på RGC: er från transected synnerven stubbe utförs vid axotomy, omedelbart efter styckning nerven. Däremot när ämnena levereras via en intraokulär väg, de kan injiceras före operationen eller inom de första tre dagarna efter operation, före initiering av apoptos i axotomized RGC: er. I denna artikel visar vi flera metoder för experimentella manipulationer efter synnerven transection.
Protocol
Discussion
Synnerven transection är en mycket reproducerbar modell för vuxna CNS-neuron apoptos. Den experimentella manipulationer visas i detta manuskript möjliggöra studier av mekanismer RGC apoptos efter skada.
Intraokulära injektioner är användbara för global inriktning av näthinnan. Denna procedur kräver lite övning, eftersom det är avgörande att inte skada linsen med spetsen på glaspipett. Lens skada har visat sig orsaka utsläpp av tillväxtfaktorer, ändra cellöverlevnad och för…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PDK stöds av en CIHR driftsbidrag (MOP 86.523)
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Stereotaxic Frame | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Rat Gas Mask | Stoelting, Kopf, WPI | |||
| Anesthesia System | VetEquip | 901806 | ||
| Isoflurane (PrAErrane) | Baxter Corp | DIN 02225875 | ||
| Surgical Microscope | WPI, Zeiss, Leica | |||
| Alcaine Eye Drops | Alcon | |||
| Tears Naturale P.M. | Alcon | |||
| Fine tip Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | ||
| 10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2) | Hamilton Syringe Co. | 80030 | ||
| 1/16 inch Compression Fittings | Hamilton Syringe Co. | 55751-01 | ||
| 1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing | Supelco, Bellefonte, PA | Z226661 | ||
| Dual RN Glass Coupler | Hamilton Syringe Co. | 55752-01 | ||
| Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa | Hamilton Syringe Co. | PRMKIT |
Riferimenti
- Bahr, M. Live or let die – retinal ganglion cell death and survival during development and in the lesioned adult CNS. Trends Neurosci. 23, 483-4890 (2000).
- Isenmann, S., Kretz, A., Cellerino, A. Molecular determinants of retinal ganglion cell development, survival, and regeneration. Prog Retin Eye Res. 22, 483-543 (2003).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. Growth and guidance cues for regenerating axons: where have they gone. J Neurobiol. 59, 162-180 (2004).
- Weishaupt, J. H., Bahr, M. Degeneration of axotomized retinal ganglion cells as a model for neuronal apoptosis in the central nervous system – molecular death and survival pathways. Restor. Neurol. Neurosci. 19, 1-2 (2001).
- Arai-Gaun, S. Heme oxygenase-1 induced in muller cells plays a protective role in retinal ischemia-reperfusion injury in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 4226-4232 (2004).
- Bainbridge, J. W., Tan, M. H., Ali, R. R. Gene therapy progress and prospects: the eye. Gene Ther. 13, 1191-1197 (2006).
- Polo, A. D. i. Prolonged delivery of brain-derived neurotrophic factor by adenovirus-infected Muller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 3978-3983 (1998).
- Herard, A. S. siRNA targeted against amyloid precursor protein impairs synaptic activity in vivo. Neurobiol Aging. 27, 1740-1750 (2006).
- Koeberle, P. D., Bahr, M. The upregulation of GLAST-1 is an indirect antiapoptotic mechanism of GDNF and neurturin in the adult CNS. Cell Death Differ. 15, 471-483 (2008).
- Koeberle, P. D., Gauldie, J., Ball, A. K. Effects of adenoviral-mediated gene transfer of interleukin-10, interleukin-4, and transforming growth factor-beta on the survival of axotomized retinal ganglion cells. Neuroscienze. 125, 903-920 (2004).
- Naik, R., Mukhopadhyay, A., Ganguli, M. Gene delivery to the retina: focus on non-viral approaches. Drug Discov Today. 14, 306-315 (2009).
- van Adel, B. A. Delivery of ciliary neurotrophic factor via lentiviral-mediated transfer protects axotomized retinal ganglion cells for an extended period of time. Hum Gene Ther. 14, 103-115 (2003).
- Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
- Allocca, M. AAV-mediated gene transfer for retinal diseases. Expert Opin Biol Ther. 6, 1279-1294 (2006).
- Surace, E. M., Auricchio, A. Versatility of AAV vectors for retinal gene transfer. Vision Res. 48, 353-359 (2008).
- Garcia-Valenzuela, E. Axon-mediated gene transfer of retinal ganglion cells in vivo. J Neurobiol. 32, 111-122 (1997).
- Koeberle, P. D., Wang, Y., Schlichter, L. C. Kv1.1 and Kv1.3 channels contribute to the degeneration of retinal ganglion cells after optic nerve transection in vivo. Cell Death Differ. 17, 134-144 (2010).
- Kugler, S. Transduction of axotomized retinal ganglion cells by adenoviral vector administration at the optic nerve stump: an in vivo model system for the inhibition of neuronal apoptotic cell death. Gene Ther. 6, 1759-1767 (1999).
- Lingor, P. Down-regulation of apoptosis mediators by RNAi inhibits axotomy-induced retinal ganglion cell death in vivo. Brain. 128, 550-558 (2005).
- Leon, S. Lens injury stimulates axon regeneration in the mature rat optic nerve. J Neurosci. 20, 4615-4626 (2000).
- Mansour-Robaey, S. Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 1632-1636 (1994).
- D’Onofrio, P. M., Magharious, M. M., Koeberle, P. D. Optic Nerve Transection: A Model of Adult. J Vis Exp. , .
