I denna video visar vi hur man tillämpar en konduktans i en dopaminerga neuron registreras i hela cellen konfiguration i skivor råtta hjärnan. Denna teknik kallas den dynamiska klämman.
Neuroforskare studera hjärnans funktion genom att undersöka hur nervceller i hjärnan kommunicerar. Många utredare titta på förändringar i den elektriska aktiviteten i en eller flera nervceller som svar på ett experimentellt kontrollerade ingång. Den elektriska aktiviteten i nervceller kan spelas in i isolerade hjärnan skivor med hjälp av tekniker patch clamp med glas mikropipetter. Traditionellt kan praktiker härma neuronala ingång genom direkt injicering av ström genom pipetten, elektrisk stimulering av de andra cellerna eller återstående axonal anslutningar i segmentet, eller farmakologisk manipulation av receptorer som finns på neuronala membran av det inspelade cellen.
Likström injektionen fördelar som passerar en förutbestämd vågform med hög temporal precision på platsen för inspelningen (vanligtvis soma). Däremot ändras inte motståndet av neuronala membran som ingen jonkanaler fysiskt öppnas. Aktuell injektion använder oftast rektangulär pulser och därför inte modell kinetiken av jonkanaler. Slutligen kan nuvarande injektion inte efterlikna kemiska förändringar i cellen som sker med öppnandet av jonkanaler.
Receptorer kan vara fysiskt aktiveras av elektrisk eller farmakologisk stimulering. Försöksledaren har goda tidsmässiga precision aktivering av receptorn med elektrisk stimulering av segmentet. Det finns dock begränsad rumslig precision på aktivering av receptorn och den exakta innebörden av vad som aktiveras vid stimulering är okänd. Det senare problemet kan delvis lindras genom specifika farmakologiska agenter. Tyvärr är den tid under aktivering av farmakologiska agenter vanligtvis långsam och den rumsliga precision ingångar på inspelade cellen är okänd.
Den dynamiska clamp tekniken tillåter en försöksledaren att ändra den aktuella gick direkt in i cellen bygger på feedback i realtid av membranet potentialen i cellen (Robinson och Kawai 1993, Sharp et al, 1993a, b;. För granskning, se Prinz et al. 2004). Detta möjliggör en försöksledaren att efterlikna de elektriska förändringar som sker på platsen för inspelningen som svar på aktivering av en receptor. Ändringar i realtid i tillämpad aktuella styrs av en matematisk ekvation genomförs i hårdvara.
Vi har nyligen använt den dynamiska klämman tekniken för att undersöka generationen av skurar av aktionspotential genom phasic aktivering av NMDA-receptorer i dopaminerga nervceller i substantia nigra pars compacta (Deister et al, 2009;. Lobb et al, 2010.). I denna video visar vi de förfaranden som behövs för att tillämpa en NMDA-receptorn konduktans i en dopaminerga neuron.
Den dynamiska clamp tekniken visat här förbättrar den traditionella tekniken för likström injektion genom att låta försöksledaren att härma den elektriska effekten av en aktivering av en receptor. I den här filmen har vi visat att man kan lägga till effekterna av aktivering av en NMDA-receptorn till spontan aktivitet i dopaminerga neuron, dvs en explosion av aktionspotentialer frammanade.
Tack vare flexibiliteten i hårdvara / mjukvara genomförande, kan en mängd olika tillägg användas. Tecknet av den injicerade strömmen kan kopplas om från negativt till positivt, vilket motsvarar ett scenario där effekterna av aktiverade receptorn tas bort från en neuron. Modell nervceller, representerad i form en serie av differentialekvationer, kan också vara numeriskt lösa och låta försöksledaren att undersöka små nätverk.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av MH084494 (CJL) och MH079276 och NS060658 (CAP).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
K-gluconate anhydrous | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
HEPES | Reagent | Fisher Scientific | ||
CaCl2 X 2H2O | Reagent | Fisher Scientific | ||
Ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Reagent | EGTA; Sigma-Aldrich | ||
MgATP | Reagent | MP Biomedicals | ||
NaGTP | Reagent | MP Biomedicals | ||
MgCl2 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
NaHCO3 | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
KCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
NaH2PO4, Anhydrous | Reagent | Fisher Scientific | ||
Glucose | Reagent | Acros Organics | ||
NaCl | Reagent | Fisher Scientific | ||
CholCl | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
Sodium Pyruvate | Reagent | Fisher Scientific | ||
Ascorbic Acid | Reagent | Acros Organics | ||
Glutathione | Reagent | Sigma-Aldrich | ||
Olympus BX51WI Microscope (with 40x objective) | Microscope | Olympus | ||
2 A/D converters | Equipment | e.g. Heka Instruments Inc. ITC-18, National Instruments BNC-2090A | ||
Multiclamp 700B with CV-7B headstage | Equipment | Molecular Devices | ||
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Equipment | Sutter Instrument Company | ||
Microfil syringe needles | Equipment | World Precision Instruments | ||
Micromanipulator | Equipment | Siskiyou, Inc. | ||
Monitor | Equipment | Triview |