Генетические ассоциации часто остаются невыясненными на функциональном уровне. Этот метод предназначен для оценки влияния фенотипа связанных генетических маркеров на экспрессию генов, анализируя клетках гетерозиготных по транскрипции SNP. Технология позволяет точному измерению, MALDI-TOF масс-спектрометрии для количественного аллель-специфических продуктов удлинения праймера.
Ряд существенных генетических ассоциаций с общим комплексом черт постоянно растет. Однако, большинство этих ассоциаций не понял на молекулярном уровне. Одним из механизмов посредническую эффект ДНК вариантов на фенотипов экспрессии генов, которое было показано, что особенно актуально для сложных признаков 1.
Этот метод испытания в сотовой связи влиянии специфических последовательностей ДНК на экспрессию генов. Принцип заключается в измерении относительного содержания стенограммы, вытекающих из двух аллелей гена, анализа клетки, которые несут по одной копии ДНК, связанные с болезнью (риск вариантов) 2,3. Таким образом, клетки, используемые для этого метода должно отвечать двум основным генотипической требования: они должны быть как для гетерозиготных вариантов ДНК риска и для ДНК-маркеров, как правило кодирования полиморфизмов, которые можно выделить на основе стенограмм их хромосомного происхождения (рис. 1). ДНК риск варианты и ДНК-маркеров, не должны иметь одинаковую частоту аллеля а фаза (haplotypic) связь генетических маркеров, необходимо понимать. Важно также выбрать типы клеток, которые выражают интерес гена. Этот протокол относится конкретно к процедуре, принятой для извлечения нуклеиновых кислот из фибробластов, но метод в равной степени применимо к другим типам клеток, включая первичные клетки.
ДНК и РНК, взяты из выбранных клеточных линий и кДНК генерируется. ДНК и кДНК анализируются с анализа удлинения праймера, разработанные с целью кодирования ДНК-маркеров 4. Анализ удлинения праймера осуществляется с помощью MassARRAY (Sequenom) 5 платформы в соответствии со спецификациями завода-изготовителя. Продуктов удлинения праймера которые затем анализируются на матрицу-активированная лазерная десорбция / ионизация время-пролетного масс-спектрометрии (MALDI-TOF/MS). Поскольку выбранные маркеры гетерозиготных они будут генерировать два пика на профили MS. Площадь каждого пика пропорциональна стенограмму изобилии и могут быть измерены с функцией программного обеспечения Typer MassARRAY генерировать аллельных отношение (аллель 1: аллель 2) расчета. Аллельных соотношение получено для кДНК нормирован с использованием этого измеряется от геномной ДНК, где соотношение аллелей, как ожидается, 1:01 для корректировки технических артефактов. Маркеры с нормированной аллельных соотношение значительно отличается от 1 показывают, что количество стенограмму генерируется из двух хромосом в одной камере отличается, предполагая, что ДНК варианты, связанные с фенотипом влияние на экспрессию генов. Экспериментальные контроля должны быть использованы для подтверждения результатов.
Этот метод позволяет оценить влияние болезни, связанные вариантов ДНК на экспрессию генов путем оценки в естественных условиях аллель-специфической разница в стенограмме уровне. В этом протоколе относительное изобилие стенограмму измеряется MALDI-TOF, но и других технологий, позволяющих аллель-специфической количественного определения, такие как TaqMan 6,7, может быть использован. Основным недостатком такого подхода является наличие транскрипции кодирования маркеров. Методы, основанные на принципе, описанные здесь, но воспользоваться различными классами полиморфизмов, были описаны. Анализ haploChip меры аллель-специфическая экспрессия с помощью маркеров расположенных в пределах 1 кб транскрипционных начало или конец сайте гена, который будет присутствовать в хроматин иммунопреципитации материала изолированы антитела, специфичные к РНК-полимеразы II 8. Кроме того, интронных ОНП можно использовать, когда шаблон гетероядерных РНК 9.
Конкретного протокола, описанные здесь, в сочетании с анализа haploChip, успешно используется для идентификации генов-кандидатов для дислексией (или чтение инвалидности). Первоначально генетические исследования ассоциации определили последовательность ДНК, связанных с дислексией и который был охватывающих три гена 10. Аллель-специфической анализа экспрессии генов показал, что в присутствии дислексии связанной изменение экспрессии ДНК вариантов наблюдался лишь у одного из трех генов, а не двумя другими 11.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |