Associations génétiques restent souvent inexpliquées au niveau fonctionnel. Cette méthode vise à évaluer l'effet du phénotype associé marqueurs génétiques sur l'expression des gènes par l'analyse de cellules hétérozygotes pour SNP transcrites. La technologie permet une mesure précise par MALDI-TOF spectrométrie de masse pour quantifier allèle-spécifique des produits d'extension d'amorces.
Le nombre d'associations génétiques significatives avec des traits communs complexe est en constante augmentation. Cependant, la plupart de ces associations n'ont pas été compris au niveau moléculaire. Un des mécanismes de médiation de l'effet des variants d'ADN sur des phénotypes est l'expression des gènes, qui a été montré pour être particulièrement pertinent pour les traits complexes 1.
Cette méthode teste dans un contexte cellulaire de l'effet de séquences d'ADN spécifiques sur l'expression génique. Le principe est de mesurer l'abondance relative des transcrits issus des deux allèles d'un gène, l'analyse des cellules qui portent une copie des séquences d'ADN associées à la maladie (les variantes de risque) 2,3. Par conséquent, les cellules utilisées pour cette méthode doit répondre à deux exigences fondamentales génotypique: ils doivent être hétérozygotes à la fois pour le risque variantes de l'ADN et des marqueurs de l'ADN, polymorphismes généralement de codage, qui permet de distinguer les transcriptions en fonction de leur origine chromosomique (Figure 1). Variantes de risque de l'ADN et des marqueurs d'ADN n'ont pas besoin d'avoir la fréquence de l'allèle mêmes, mais la phase (haplotypique) relation des marqueurs génétiques doit être comprise. Il est également important de choisir des types de cellules qui expriment le gène d'intérêt. Ce protocole se réfère spécifiquement à la procédure adoptée pour extraire les acides nucléiques à partir de fibroblastes, mais la méthode est également applicable à d'autres types de cellules, y compris des cellules primaires.
ADN et ARN sont extraits à partir des lignées cellulaires sélectionnées et d'ADNc est généré. ADN et d'ADNc sont analysées avec un test d'extension d'amorces, conçu pour cibler les marqueurs d'ADN codant 4. Le test extension d'amorce est réalisée en utilisant les MassARRAY (Sequenom) 5 plate-forme selon les spécifications du fabricant. Produits d'extension d'amorce sont ensuite analysées par laser assistée par matrice de désorption / ionisation de temps de vol spectrométrie de masse (MALDI-TOF/MS). Parce que les marqueurs sélectionnés sont hétérozygotes, ils génèrent deux pics sur les profils de MS. La surface de chaque pic est proportionnelle à l'abondance et la transcription peut être mesurée avec une fonction du logiciel Typer MassARRAY pour générer un rapport allélique (allèle 1: allèle 2) du calcul. Le ratio obtenu pour allélique ADNc est normalisé en utilisant celle mesurée à partir d'ADN génomique, où le ratio allélique devrait être de 1:1 pour corriger les artefacts techniques. Marqueurs avec un ratio normalisé alléliques significativement différente de 1 indiquent que la quantité de transcrit généré par les deux chromosomes dans la même cellule est différente, ce qui suggère que les variantes génétiques associées au phénotype ont un effet sur l'expression des gènes. Contrôles expérimentaux devraient être utilisées pour confirmer les résultats.
Cette méthode permet d'évaluer l'effet des maladies associées aux variantes de l'ADN sur l'expression génique par l'évaluation dans le allèle-spécifique in vivo de différence dans le niveau de transcription. Dans ce protocole d'abondance relative est mesurée la transcription par MALDI-TOF, mais d'autres technologies permettant la quantification allèle-spécifique, tels que TaqMan 6,7, peut être utilisé. La principale limitation de cette approche est la disponibilité des transcrits des marqueurs de codage. Méthodes basées sur le principe décrit ici, mais en profitant des différentes classes de polymorphismes ont été décrits. Le dosage de haploChip mesures spécifiques d'un allèle d'expression en utilisant des marqueurs situés dans 1 kb de l'initiation de la transcription ou le site fin d'un gène qui serait présent dans la chromatine du matériel immunoprécipité isolés avec des anticorps spécifiques à l'ARN polymérase II 8. Alternativement, les SNP intronique peut être utilisé lorsque le modèle est hétéronucléaires ARN 9.
Le protocole spécifique décrit ici, en combinaison avec le dosage haploChip, a été utilisée avec succès pour identifier un gène candidat pour la dyslexie (ou d'un handicap de lecture). Initialement une étude d'association génétique identifié une séquence d'ADN associés à la dyslexie et qui a été couvrant trois gènes 10. L'allèle épreuves spécifiques ont montré que l'expression des gènes dans la présence de la dyslexie associée variations d'expression d'ADN variantes a été observé pour un seul des trois gènes, mais pas les deux autres 11.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |