Associações genéticas freqüentemente permanecem sem explicação em um nível funcional. Este método tem como objetivo avaliar o efeito do fenótipo associado marcadores genéticos na expressão do gene através da análise de células heterozigotos para SNPs transcritas. A tecnologia permite uma medição precisa por espectrometria de massa MALDI-TOF para quantificar alelo-específico produtos de extensão de primer.
O número significativo de associações genéticas com características complexas comuns está aumentando constantemente. No entanto, a maioria destas associações não foram compreendidas a nível molecular. Um dos mecanismos de mediação do efeito de variantes de DNA em fenótipos é de expressão gênica, que tem se mostrado particularmente relevante para traços complexos 1.
Este método testa em um contexto celular o efeito de seqüências específicas de DNA na expressão gênica. O princípio é medir a abundância relativa de transcritos resultantes dos dois alelos de um gene, análise de células que carregam uma cópia de seqüências de DNA associadas com a doença (a variantes de risco) 2,3. Portanto, as células usadas para este método deve atender a dois requisitos fundamentais genotípica: eles têm que ser heterozigotos tanto para variantes de risco DNA e dos marcadores de DNA, polimorfismos tipicamente codificação, o que pode distinguir transcrições com base em sua origem cromossômicas (Figura 1). Variantes de DNA de risco e marcadores de DNA não precisa ter a freqüência do alelo mesmo, mas a fase de relacionamento (haplotypic) dos marcadores genéticos precisa ser entendido. Também é importante escolher os tipos de células que expressam o gene de interesse. Este protocolo se refere especificamente ao procedimento adotado para extração dos ácidos nucléicos a partir de fibroblastos, mas o método é igualmente aplicável a outros tipos de células, incluindo células primárias.
DNA e RNA são extraídos das linhagens de células selecionadas e cDNA é gerado. DNA e cDNA são analisados, com um teor de extensão de primer, projetado para atacar os marcadores de DNA de codificação 4. O ensaio de extensão de primer é realizado usando o MassARRAY (Sequenom) 5 plataforma de acordo com as especificações do fabricante. Produtos de extensão de primer são então analisados por matrix-assisted laser de dessorção / ionização de tempo de vôo-espectrometria de massa (MALDI-TOF/MS). Porque os marcadores selecionados são heterozigotos que irá gerar dois picos nos perfis de MS. A área de cada pico é proporcional à abundância transcrição e pode ser medido com uma função do software Typer MassARRAY para gerar uma relação de alelos (alelo 1: alelo 2) cálculo. A proporção alélica obtida para cDNA é normalizada usando essa medida a partir do DNA genômico, onde a proporção alélica deve ser de 1:1 para corrigir artefatos técnicos. Marcadores com uma relação normalizada alélicas significativamente diferentes de 1 indicam que a quantidade de transcrição gerados a partir de dois cromossomos na mesma cela é diferente, sugerindo que as variantes do DNA associado com o fenótipo ter um efeito sobre a expressão gênica. Controles experimentais devem ser utilizados para confirmar os resultados.
Este método permite a avaliação do efeito da doença associada a variantes de DNA na expressão do gene através da avaliação in vivo alelo-específico diferença no nível de transcrição. Neste protocolo abundância transcrição relativa é medida por MALDI-TOF, mas outras tecnologias que permite a quantificação alelo-específico, como TaqMan 6,7, pode ser usado. A principal limitação dessa abordagem é a disponibilidade de transcritos marcadores de codificação. Métodos baseados no princípio descrito aqui, mas aproveitando as diferentes classes de polimorfismos, têm sido descritas. O ensaio haploChip medidas alelo-específico expressão usando marcadores localizados a 1 kb do início da transcrição ou site final de um gene que estaria presente na cromatina materiais immunoprecipitated isolados com anticorpos específicos para o RNA polimerase II 8. Alternativamente, SNPs intrônicos pode ser utilizado quando o modelo é heteronuclear RNA 9.
O protocolo específico descrito aqui, em combinação com o ensaio haploChip, tem sido utilizado com sucesso para identificar um gene candidato para a dislexia (ou incapacidade de leitura). Inicialmente um estudo de associação genética identificada uma seqüência de DNA associado com a dislexia e que foi ao longo de três genes 10. O alelo-específico do ensaio de expressão gênica mostrou que na presença da dislexia associados variação DNA expressão variantes foi observado por apenas um dos três genes, mas não os outros dois 11.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |