Genetiska föreningar är ofta oförklarlig på en funktionell nivå. Denna metod syftar till att bedöma effekten av fenotyp associerad genetiska markörer på genuttryck genom att analysera celler heterozygot för transkriberas SNP. Tekniken möjliggör exakta mätningar av MALDI-TOF masspektrometri för att kvantifiera allel-specifika produkter primer förlängning.
Antalet signifikanta genetiska samband med gemensamma komplexa egenskaper ökar hela tiden. Emellertid har de flesta av dessa föreningar inte förstod på molekylär nivå. En av de mekanismer som förmedlar effekten av DNA-varianter på fenotyper är genuttryck, som har visat sig vara särskilt relevanta för komplexa egenskaper 1.
Denna metod tester i en cellulär sammanhang effekten av specifika DNA-sekvenser på genuttryck. Principen är att mäta den relativa förekomsten av avskrifter till följd av två alleler av en gen, analysera celler som bär en kopia av DNA-sekvenser i samband med sjukdom (risken varianterna) 2,3. Därför bör de celler som används för denna metod uppfylla två grundläggande genotypisk krav: de måste heterozygot för både varianterna DNA risk och för DNA-markörer, typiskt kodning polymorfismer, som kan skilja utskrifterna baserat på deras kromosomala ursprung (figur 1). DNA-risk varianter och markörer DNA behöver inte ha samma allelen frekvens men fasen (haplotypic) Förhållandet mellan genetiska markörer måste förstås. Det är också viktigt att välja celltyper som uttrycker genen av intresse. Det här protokollet hänvisas särskilt till det förfarande som antagits för att extrahera nukleinsyror från fibroblaster men metoden är lika tillämpliga på andra celler typer inklusive primära celler.
DNA och RNA extraheras från utvalda cellinjer och cDNA genereras. DNA och cDNA analyseras med en primer förlängning analys, som avser att rikta kodande DNA-markörer 4. Primern förlängning analysen utförs med MassARRAY (Sequenom) 5-plattform enligt tillverkarens specifikationer. Primer förlängning produkter analyseras sedan av matris-assisterad laser desorption / jonisering tid för flygning masspektrometri (MALDI-TOF/MS). Eftersom de utvalda markörerna är heterozygota de kommer att generera två toppar på MS-profiler. Området för varje topp är proportionell mot avskriften överflöd och kan mätas med en funktion av MassARRAY Typer programvara för att generera en allela förhållande (allelen 1: allel 2) beräkning. Den allela förhållandet som erhålls för cDNA normaliseras med hjälp av att mätt från genomiska DNA, där allela förhållandet förväntas vara 1:1 för att korrigera för tekniska artefakter. Markörer med en normaliserad allela förhållande väsentligt annorlunda än 1 tyder på att mängden utskrift genereras från de två kromosomer i samma cell är annorlunda, vilket tyder på att DNA-varianter i samband med fenotyp har en effekt på genuttryck. Experimentell kontroller bör användas för att bekräfta resultaten.
Denna metod möjliggör utvärdering av effekten av sjukdomar förknippade DNA-varianter på genuttryck genom att bedöma in vivo allelspecifik skillnad i avskrift nivå. I detta protokoll relativa avskrift överflöd mäts med MALDI-TOF, men andra tekniker gör allelspecifik kvantifiering, såsom TaqMan 6,7, kan användas. Den största begränsningen av denna metod är att det finns transkriberade kodning markörerna. Metoder som bygger på den princip som beskrivs här, men att dra nytta av olika klasser av polymorfismer, har beskrivits. Den haploChip analys mäter allelspecifik uttryck med hjälp av markörer ligger inom 1 kB för transkriptionell början eller slutet platsen för en gen som skulle vara närvarande i kromatin immunoprecipitated material som isoleras med antikroppar som är specifika för RNA-polymeras II 8. Alternativt kan intronic SNP användas när mallen heteronukleär RNA 9.
De specifika protokoll som beskrivs här, i kombination med haploChip analysen har använts framgångsrikt för att identifiera en kandidat gen för dyslexi (eller läs-och skrivsvårigheter). Inledningsvis en genetisk förening studie identifierat en DNA-sekvens i samband med dyslexi och som spänner över tre gener 10. Den allelspecifik genuttryck-test visade att i närvaro av dyslexi-associerade DNA-varianter uttryck variation observerades för endast en av tre gener, men inte de andra två 11.
The authors have nothing to disclose.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
PBS | Sigma | P-4417-100TAB | ||
SDS | Biorad | 161-0416 | ||
NaCl | VWR | 27788.366 | ||
Tris | Sigma | T1503-1KG | ||
EDTA | Sigma | E5134-500G | ||
RNase A | Qiagen | 19101 | ||
Proteinase K | Sigma | P2308-500MG | ||
Phenol: chloroform | Sigma | 77617 | ||
Chloroform | VWR | 100777C | ||
Ethanol | Sigma | 32221-2.5L | ||
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | ||
RNeasy kit | Qiagen | 74104 | ||
SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080-044 | ||
Immolase Taq | Bioline | BIO-21048 | ||
dNTP | Sigma | DNTP100A | ||
Exonuclease 1 | NEB | M0293S | ||
Shrimp Alkaline Phosphatase | GE Healthcare | E70092Z | ||
SpectroCLEAN resin | Sequenom | 10053 | ||
MassEXTEND ddNTP/dNTP mix | Sequenom | Varies according to assay design | ||
MassEXTEND thermosequenase | Sequenom | 10052 | ||
Equipment | ||||
Chilled microcentrifuge | Eppendorf | |||
NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | |||
SpectroPOINT nanolitre dispenser | Sequenom | |||
SpectroREADER mass spectrometer | Sequenom |