मधुमक्खियों में सूंड एक्सटेंशन रिस्पांस के शास्त्रीय कंडीशनिंग में व्यवहार भेषजगुण ( एपिस mellifera)

Summary

हम प्रदर्शन कैसे appetitive मधुमक्खियों में घ्राण कंडीशनिंग (एपिस mellifera) दवाओं के प्रणालीगत आवेदन के द्वारा प्रतिमान में एक व्यवहार औषध पद्धति को लागू करने के लिए. इस विधि अंतर्निहित तंत्र सीखने और स्मृति गठन में एक साधारण और विश्वसनीय तरीके की जांच की अनुमति देता है.

Abstract

मधुमक्खियों (एपिस mellifera) अच्छी तरह से उनके संचार और ओरिएंटेशन कौशल के लिए और उनके प्रभावशाली ^{सीखने} की क्षमता 1,2 के लिए जाना जाता है. क्योंकि एक मधुप कॉलोनी के अस्तित्व खाद्य स्रोतों के दोहन पर निर्भर करता है, भोजन के लिये घूमनेवाला मधुमक्खियों को जानने के लिए और चर फूल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उनकी लाभप्रदता साइटों याद है. भोजन के लिये घूमनेवाला मधुमक्खियों को आसानी से प्राकृतिक सेटिंग में प्रशिक्षित किया जा सकता है है, जहां वे एक खिला साइट पर फोरेज और गंध या रंग के रूप में संबंधित संकेतों को जानने. Appetitive साहचर्य सीखने भी व्यक्तिगत रूप से इस्तेमाल ^{मधुमक्खियों} 3,4 की सूंड विस्तार प्रतिक्रिया कंडीशनिंग (प्रतिशत) के द्वारा प्रयोगशाला में नियंत्रित परिस्थितियों के तहत अध्ययन किया जा सकता है. यह सीखने प्रतिमान neuronal और आणविक तंत्र है कि एक सरल और अत्यंत विश्वसनीय तरीका ^5-12 में सीखने और स्मृति गठन आबाद अध्ययन में सक्षम बनाता है. एक व्यवहार औषध दृष्टिकोण आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. ड्रग्स प्रणालीबद्ध इंजेक्शन रहे हैं करने के लिए सीखने और स्मृति गठन ^13-16 के दौरान या बाद में विशेष के अणुओं के समारोह के साथ हस्तक्षेप.

यहाँ हम का प्रदर्शन कैसे प्रतिशत कंडीशनिंग में इस्तेमाल मधुमक्खियों को प्रशिक्षित करने के लिए और कैसे मधुमक्खी उड़ान मांसपेशियों में इंजेक्शन द्वारा प्रणालीबद्ध दवाओं लागू करने के लिए.

Protocol

1. हाइव से पकड़ने मधुमक्खियों एक दिन से पहले प्रयोग 2 और 4 बजे के बीच शुरू होता है,, छोड़ने मधुमक्खियों छत्ता पकड़े जाते हैं. ऐसा करने के लिए, एक यूवी प्रकाश पारगम्य plexiglass पिरामिड (ऊंचाई = 30 सेमी, सुप्रीम 3,5 x 3, 5 सेमी, 18 x 18 सेमी आधार), जो सर्वोच्च और आधार पर closable है 20 एक पर आयोजित किया जाता है – बेस खुला और सुप्रीम के साथ छत्ता द्वार के सामने 30 सेमी दूरी इतनी बंद कर दिया है कि हाइव छोड़ने मधुमक्खियों पिरामिड के आधार दर्ज करें. बेस और फिर बंद हो गया है पर कब्जा कर लिया मधुमक्खियों आगे से निपटने के लिए प्रयोगशाला में लाया जाता है. 2. कांच की शीशियों में पिरामिड से मधुमक्खियों का स्थानांतरण प्रयोगशाला में, पिरामिड उसके आधार पर रखा गया है. पिरामिड की दीवारों (जैसे एक तौलिया के साथ) अन्धेरा कर रहे हैं लेकिन सुप्रीम छोड़ दिया है खुला. उनके सकारात्मक phototaxis की वजह से, मधुमक्खियों सुप्रीम माध्यम पिरामिड छोड़ जब खोला जाएगा. एक के बाद एक, मधुमक्खियों पिरामिड से कांच की शीशियों में खुले सुप्रीम अधिक शीशियों पकड़े द्वारा स्थानांतरित कर रहे हैं. एक शीशी मधुमक्खी प्रति प्रयोग किया जाता है. इसलिए सुप्रीम बंद कर दिया है जब एक मधुमक्खी शीशी में प्रवेश करती है. 3. ट्यूब में मधुमक्खियों का दोहन मधुमक्खियों उन्हें 2.5-3.5 मिनट के लिए बर्फ पर कांच की शीशियों में ठंडा द्वारा immobilized हैं. यह सलाह दी जाती है मधुमक्खी घड़ी और यह बर्फ से हटाने के के रूप में जल्द ही के रूप में यह चलती रुक जाता है है. एक एकल immobilized मधुमक्खी चिपचिपा टेप के साथ एक छोटे से प्लास्टिक की ट्यूब, ऐसी है कि यह अपनी सूंड आज़ादी लेकिन उसके सिर, छाती, या पैर नहीं स्थानांतरित करने के लिए सक्षम है में इस्तेमाल किया है. यह महत्वपूर्ण है कि गर्दन नहीं संकुचित है. हर एक प्लास्टिक की नली में तय मधुमक्खी बेहतर हैंडलिंग और पहचान के लिए एक रैक पर गिने वेधन छिद्र में डाल दिया है. के बाद यह कंडीशनिंग या स्मृति पुनर्प्राप्ति के लिए हटा दिया गया है ट्यूब हमेशा सटीक एक ही वेधन छिद्र में लौट रहा है. 4. दूध पिलाने की मधुमक्खियों का पहली शाम (4-6 बजे) में पकड़ा जा रहा होने के बाद, मधुमक्खियों sucrose के समाधान (एम 0,88, सफेद परिष्कृत घरेलू नल का पानी में भंग चीनी) के साथ तुष्टि के लिए तंग आ चुके हैं. एक मधुमक्खी फ़ीड करने के लिए, उसके अनुसार प्रति sucrose के समाधान के साथ अपने एंटीना को छू और जानवर sucrose के समाधान की एक छोटी बूंद (4 μL) का उपभोग करने की अनुमति है द्वारा हासिल है. मधुमक्खियों का एक के बाद एक तंग आ चुके हैं बार बार जब तक वे अब एक तेजी से और विश्वसनीय प्रतिशत दिखाने के लिए जब उनके एंटीना sucrose के समाधान के साथ छू रहे हैं. प्रयोग मधुमक्खियों के प्रत्येक बाद शाम को (4-6 बजे) पर एक sucrose के समाधान की एक छोटी बूंद (4 μL, 0,88 एम, सफेद परिष्कृत चीनी में नल का पानी हल) के साथ एक और चार बार के बाद से तंग आ चुके हैं. यह महत्वपूर्ण है कि sucrose के समाधान है मधुमक्खी या खिलाने के दौरान एंटीना सूंड पर और ट्यूबों sucrose के समाधान के साथ नहीं दूषित कर रहे हैं कि गंदा नहीं है. मधुमक्खियों कंडीशनिंग साइट पर या निकट नहीं खिलाया sucrose के प्रोत्साहन के साथ प्रशिक्षण के संदर्भ जोड़ की संभावना को बाहर कर देना चाहिए. 5. इस्तेमाल मधुमक्खियों ओवरनाइट रखते हुए मधुमक्खियों रात एक प्लास्टिक कटोरा में कमरे के तापमान पर रखा जाता है. कटोरा (उच्च 0,5-1 लगभग सेमी) में नल का पानी भर जाता है. इस्तेमाल मधुमक्खियों के साथ रैक एक मंच के रूप में एलिसा प्लेट का उपयोग कर waterline ऊपर कटोरा में रखा जाता है. अंत में, कटोरा गत्ता के साथ कवर किया जाता है. 6. घ्राण कंडीशनिंग प्रयोग की पहली सुबह (10 हूँ) पर घ्राण कंडीशनिंग बाहर किया जाता है. वातानुकूलित उत्तेजना (सीएस) एक गंध है, असुविधाजनक उत्तेजना (यूएस) sucrose के समाधान है. गंध (जैसे लौंग के तेल) के 4 μL एक दौर फिल्टर (1,3 सेमी व्यास) कागज जो फिर एक 20 एमएल सिरिंज में डाला जाता है पर pipetted हैं. गंध एक डाकू के तहत pipetted है और फिल्टर सुझावों विंदुक के प्रदूषण को रोकने के लिए उपयोग किया जाता है. इस्तेमाल मधुमक्खियों के साथ रैक कंडीशनिंग साइट 30 मिनट के पास रखा जाता है कंडीशनिंग प्रक्रिया से पहले शुरू होता है, लेकिन एक दूरी पर एक निकास पाइप जहां एकल मधुमक्खियों वातानुकूलित हैं के सामने जगह. कंडीशनिंग गंध के तीन pairings (वातानुकूलित उत्तेजना, सीएस) और 10 मिनट के अंतराल अंतर परीक्षण (आईटीआई) के साथ sucrose के समाधान (असुविधाजनक उत्तेजना, अमेरिका, एम 1,25) के होते हैं. एक ध्वनिक संकेत experimenter के लिए एक ऑडियो खिलाड़ी के माध्यम से दिया प्रोत्साहन शुरुआत, उत्तेजना ऑफसेट, उत्तेजना अवधि और रखने के सटीक समय सुनिश्चित करता है. एक अधिग्रहण परीक्षण एक 10 सेकंड में एक निकास के सामने जानवर की नियुक्ति के साथ शुरू होता है. फौरन से पहले 10 सेकंड के अंत गंध युक्त सिरिंज मधुमक्खी एंटीना पर लक्षित मधुमक्खी के सामने में 3 सेमी रखा गया है. इसके बाद, गंध 5 सेकंड के लिए प्रस्तुत किया है, सिरिंज के माध्यम से 20 एमएल हवा धक्का द्वारा. पहले 3 सेकंड के बाद दोनों एंटीना के बाहर flagella एक sucrose के समाधान सिक्त दंर्तखोदनी और पशुओं के लिए 4 सेकंड के लिए moistend दंर्तखोदनी चाटना करने की अनुमति दी जाती है साथ छू रहे हैं. 13 सेकंड सीएस उत्तेजना समाप्त होता है, मधुमक्खियों के बाद प्रशिक्षण के संदर्भ में लिया जाता है और रैक में वापस रखा. कुल मिलाकर एक प्रशिक्षण परीक्षण 28 सेकंड तक रहता है. यह महत्वपूर्ण है कि न तो मधुमक्खी एंटीना और न ही सूंड कंडीशनिंग के बाद sucrose के साथ कवर कर रहे हैं. इसलिए यह करने के लिए सुनिश्चित किया जाना चाहिए कि दंर्तखोदनी केवल sucrose के समाधान के साथ और दन्तखुदनी पर sucrose के समाधान फार्म का कोई बूँदें कि सिक्त है. कंडीशनिंग के बाद रैक वापस कटोरा में रखा जाता है. प्रयोग के दौरान पशुओं के व्यवहार में, प्लेसमेंट और सीएस और अमेरिका प्रस्तुति के दौरान PER की घटना यानी नजर रखी है और experimenter द्वारा नीचे उल्लेख किया है. 7. मेमोरी रिटेंशन प्रतिधारण परीक्षण किसी भी अंतराल मिनट (दिन) में प्रदर्शन किया जा सकता है है. मधुमक्खियों के साथ रैक कंडीशनिंग साइट 30 मिनट के पास रखा जाता है स्मृति परीक्षण से पहले शुरू होता है. एक स्मृति परीक्षण अमेरिका की प्रस्तुति को बिना 5 सेकंड सीएस प्रस्तुति के होते हैं. परीक्षण जानवर के निकास के सामने में एक 10 सेकंड प्लेसमेंट के साथ शुरू होता है. इसके बाद, गंध 5 सेकंड के लिए प्रस्तुत किया जाता है ऊपर वर्णित के रूप में है. जानवर के व्यवहार, प्लेसमेंट के दौरान PER की घटना यानी सीएस प्रस्तुति प्रयोग के दौरान नीचे उल्लेख किया है. सूंड extention प्रतिक्रिया प्रयोग के अंत में फिर से sucrose के समाधान के साथ एंटीना छू करने के लिए सुनिश्चित करें कि पशु अभी भी अपनी सूंड का विस्तार करने में सक्षम है द्वारा हासिल है. 8. प्रणालीगत इंजेक्शन प्रणालीगत इंजेक्शन के समय बिंदु प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है. एक डिस्पोजेबल चमड़े के नीचे सुई (21 जी) का उपयोग करके उड़ान मांसपेशी 17 से ऊपर scutal विदर के लिए अगले ढाल के पीछे भाग के cuticula में एक छोटा सा छेद किया जाता है . एक गिलास केशिका ट्यूब का प्रयोग, 1 μL समाधान छेद के माध्यम से उड़ान की मांसपेशियों में cuticula में अंतःक्षिप्त है. प्रशिक्षित प्रयोगकर्ताओं के लिए हर 30 सेकंड एक मधुमक्खी इंजेक्षन, इंजेक्शन और कंडीशनिंग के एक सटीक समय की अनुमति के लिए कर रहे हैं. 9. प्रयोग के दौरान दूध पिलाने मधुमक्खियों कंडीशनिंग के बाद शाम को (4-6 बजे), मधुमक्खियों sucrose के समाधान की एक छोटी बूंद के साथ (4 μL, 0,88 एम, सफेद परिष्कृत नल का पानी में भंग चीनी) एक और चार बार के बाद से तंग आ चुके हैं. यह महत्वपूर्ण है कि sucrose के समाधान है मधुमक्खी या खिलाने के दौरान एंटीना सूंड पर और ट्यूबों sucrose के समाधान के साथ नहीं दूषित कर रहे हैं कि गंदा नहीं है. मधुमक्खियों कंडीशनिंग साइट पर या निकट नहीं खिलाया sucrose के प्रोत्साहन के साथ प्रशिक्षण के संदर्भ जोड़ की संभावना को बाहर कर देना चाहिए. 10. डेटा संग्रह और डेटा विश्लेषण सूंड विस्तार प्रतिक्रिया के प्रयोग के दौरान घटना पर नजर रखी है. एक मक्खी सकारात्मक बने है अगर यह सीएस की शुरुआत और अमेरिका की प्रस्तुति (प्रशिक्षण के दौरान) के बीच या सीएस प्रस्तुति (परीक्षण चरण के दौरान) के दौरान अपनी सूंड से फैली है, खुले mandibles के बीच एक आभासी लाइन पार. विश्लेषण पशुओं में शामिल किया जाना दो मानदंडों को पूरा करना चाहिए: वे पूरे प्रयोग जीवित है और वे प्रयोग के अंत में असुविधाजनक सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रतिशत) sucrose के समाधान के लिए दिखाना चाहिए. अधिग्रहण और प्रतिधारण परीक्षण के दौरान अनुसार प्रति दिखा मधुमक्खियों का प्रतिशत प्रत्येक सीएस प्रस्तुति के लिए योजना बनाई है. 11. प्रतिनिधि परिणाम: दो प्रयोगों यहाँ प्रस्तुत कर रहे हैं. पहले प्रयोग में हम फॉस्फेट-buffered खारा (पीबीएस के प्रणालीगत इंजेक्शन के प्रभाव को देखो, में मिमी: 137 NaCl, 2,7 KCl, 10,1 ना 2 HPO 4, 1,8 2 के.एच. पीओ 4, 7 पीएच, 2) सीखने और दीर्घकालिक स्मृति गठन पर. अंतर परीक्षण 10 मिनट के अंतराल में तीन के साथ सीएस अमेरिका pairings के साथ मक्खियों के तीन समूहों को प्रशिक्षित किया गया: एक गैर इलाज समूह, एक समूह है कि प्रशिक्षण से पहले 1 μL पीबीएस 30 मिनट इंजेक्शन के साथ किया गया था, और नकली इंजेक्शन के एक समूह का इलाज पीबीएस इंजेक्शन समूह के रूप में लेकिन पीबीएस इंजेक्शन के बिना एक ही तरीका है. स्मृति प्रशिक्षण के बाद 24 घंटे के सभी तीन समूहों में सीएस प्रस्तुति के साथ परीक्षण किया गया था. कंडीशनिंग के दौरान वातानुकूलित प्रतिक्रिया दिखा पशुओं का प्रतिशत तीन प्रशिक्षण परीक्षणों भर काफी बढ़ जाती है (Fig.1, कारक समय के लिए दोहराया माप लिए एनोवा एफ 2378 = 340,456, <0,05 पी). PER में कोई फर्क कंडीशनिंग के दौरान तीन समूहों के बीच मनाया जा सकता है (कारक समूहों F2, 189 = 1299, 0,05> पी के लिए दोहराया माप के लिए एनोवा). यह एक 24 घंटे प्रतिधारण परीक्षण (F2, 187 0,752 =,> 0,05 पी) के लिए सच है जब पीबीएस इंजेक्शन और नकली इंजेक्शन पशुओं के साथ गैर इलाज पशुओं की तुलना. दूसरे प्रयोग में हम स्मृति प्रतिधारण तीन के निषेध और प्रशिक्षण के बाद चार दिनों जब प्रोटीन संश्लेषण अवरोध करनेवाला anisomycin (10 मिमी) प्रणालीबद्ध तीन सीएस अमेरिका pairings के बाद 30 मिनट इंजेक्शन प्रदर्शित करता है. Anisomycin इंजेक्शन एक पीबीएस इंजेक्शन समूह के साथ एक समूह की तुलना प्रतिधारण टी के दौरान समूहों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर का पता चलता हैस्था (Fig.2, कारक समूह F1, 94 के लिए दोहराया माप के लिए एनोवा = 8,86, 0,05 <पी). 3 दिन और 4 दिन पर स्मृति परीक्षण में एक बड़ा अंतर देखा जा सकता है है. यह Wüstenberg एट अल के परिणाम जैसा दिखता है 18, जो भी एक अलग प्रोटोकॉल के साथ तीन सीएस अमेरिका pairings के साथ मधुमक्खियों , हालांकि वातानुकूलित. चित्रा 1. Cuticula घाव या पीबीएस के इंजेक्शन अधिग्रहण और स्मृति प्रतिधारण को बदल नहीं है. पशु तीन CS – अमेरिका pairings (अधिग्रहण) के साथ प्रशिक्षित किया गया. 24 घंटे के बाद, स्मृति (मेमोरी प्रतिधारण) परीक्षण किया गया था. तीस मिनट के प्रशिक्षण के लिए पहले, एक छेद के दो समूहों के cuticula में बनाया गया था (घाव, Pbs) और इन समूहों में से एक μL पीबीएस (पीबीएस) के साथ अंतःक्षिप्त किया गया था. एक तीसरा समूह बरकरार छोड़ दिया गया था (कोई इलाज). प्रस्तुत प्रत्येक समूह के अनुसार प्रति के साथ गंध प्रस्तुति का जवाब देने के लिए पशुओं का प्रतिशत है. एक एनोवा अधिग्रहण चरण में समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद प्रकट नहीं करता है (F2, 189 = 1.299, 0.05 पी>) या स्मृति प्रतिधारण में (F2, 187 = 0.752, 0.05 पी>). चित्रा 2. पिछले बाँधना सीएस – अमेरिका के बाद 40 मिनट anisomycin इंजेक्शन स्मृति तीन दिन प्रतिधारण और चार दिन के प्रशिक्षण के बाद कम कर देता है पशु तीन CS – अमेरिका pairings (अधिग्रहण) के साथ प्रशिक्षित थे और 1 μL 10 मिमी (Aniso) anisomycin या 1 μL पीबीएस के साथ इंजेक्शन पहला प्रशिक्षण परीक्षण के बाद 1 घंटे. स्मृति (मेमोरी प्रतिधारण) 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे और 96 घंटे बाद परीक्षण किया गया था. प्रस्तुत समूह प्रति पशुओं का प्रतिशत प्रति एक साथ प्रस्तुति गंध का जवाब है. anisomycin के इंजेक्शन स्मृति प्रतिधारण 72 घंटे और 96 घंटे के प्रशिक्षण के बाद एक महत्वपूर्ण कमी (F1, 94 = 8.86, पी <0.05) के रूप में एक एनोवा से पता चला की ओर जाता है है.

Discussion

1. मधुमक्खियों पकड़ने: अनुभवी foraging मधुमक्खियों इकट्ठा, मधुमक्खियों या तो सुबह या दोपहर में पकड़े जाते हैं, समय था जब युवा मधुमक्खियों ^{अभिविन्यास} 19 उड़ानों पर हैं से परहेज. Foragers या तो पराग या अमृत इकट्ठा. पराग और अमृत foragers के बीच अंतर उनके चीनी जवाबदेही और उनके ^{सीखने} 20 क्षमताओं के अनुसार मनाया गया है . आदेश में केवल अमृत foragers को पकड़ने के लिए, एक sucrose के समाधान के साथ भरा एक कृत्रिम भोजन स्रोत हाइव और जानवरों के पास स्थापित किया जा सकता वहाँ एकत्र किया जा सकता है. पराग हाइव के लिए लौटने foragers उनके पिछले ²⁰ पैरों पर पराग टोकरी द्वारा पहचाना जा सकता है.
2. फिक्सिंग और हैंडलिंग: बर्फ पर मधुमक्खियों के विस्तारित ठंडा है क्योंकि यह अपने को जानने के लिए और प्रयोग के अंत तक जीवित रहने की क्षमता प्रभावित हो सकती है बचा जाना चाहिए. Tarsi ध्यान ट्यूब के भीतर तय हो sucrose के समाधान के साथ आकस्मिक उत्तेजना से बचने के है. यह महत्वपूर्ण है, क्योंकि मधुमक्खियों succrose ^3,21 समाधान के साथ tarsal उत्तेजना से सीखने के लिए दिखाया गया है.
3. घ्राण कंडीशनिंग: कंडीशनिंग परीक्षणों की संख्या, अंतराल अंतर परीक्षण, परीक्षण और परीक्षण के समय बिंदु ^3,22 अध्ययन का ध्यान केंद्रित के आधार पर अलग किया जा सकता है.
4. दूध पिलाने की: मधुमक्खियों की तुष्टि स्तर उनके सीखने प्रदर्शन और स्मृति प्रतिधारण ^3,23 को प्रभावित करने के लिए जाना जाता है. इस खाते में ले लिया हो सकता है जब प्रयोगों की योजना बना है.
5. इंजेक्शन: एयर थैलियों मधुप छाती ¹⁷ में स्थित हैं. श्वसन प्रणाली के इन महत्वपूर्ण भागों के अस्तित्व के लिए आवश्यक हैं. इस प्रकार देखभाल इंजेक्शन के दौरान हवा की थैलियों को नुकसान नहीं लिया होना चाहिए. हवाई बुलबुले की रिहाई हवा की थैलियों को नुकसान इंगित करता है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Syringe Omnifix 20 ml		B.Braun, Melsungen, Germany	4616200 V
White refined household sugar		Kaisers Supermarket, Berlin, Germany
Clove oil		Bombastus, Freital, Germany
Multipette plus		Eppendorf, Hamburg, Germany	4981 000.019
Rack for 30 bee tubes		Self-made
Plastic tubes		Self-made
UV light-permeable plexiglass pyramid		Self-made		height = 30cm, apex 3.5 x 3.5cm, base 18x18cm
Sticky tape		Tesa, Hamburg, Germany
Capillator sticks 1-5μl		Selzer, Driedorf-Roth, Germany
Capillator tips 1-5μl		Selzer, Driedorf-Roth, Germany
Filter paper 0.16-0.2 mm thick		Macherey-Nagel, Düren, Germany	MN 616 or MN615	Adjusted to circular pieces with a 1.3 cm diameter
Disposable hypodermic needle		B. Braun, Melsungen, Germany	4657683	0.45 mm diameter