Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X
Summary
La structure 3-D d'une molécule donne une compréhension unique de la façon dont les fonctions molécule. La principale méthode de détermination de la structure au quasi-atomique résolution est cristallographie aux rayons X. Ici, nous montrons les méthodes actuelles pour l'obtention de trois dimensions des cristaux de toute macromolécule donnée qui conviennent pour la détermination de structure par cristallographie aux rayons X.
Abstract
Utilisation de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques de déduire comment ils fonctionnent est l'un des domaines les plus importants de la biologie moderne. La disponibilité des structures de résolution atomique fournit une compréhension profonde et unique de la fonction des protéines, et les aide à démêler les rouages internes de la cellule vivante. À ce jour, 86% de la Protein Data Bank (RCSB-PDB) sont entrées structures macromoléculaires qui ont été déterminés en utilisant cristallographie aux rayons X.
Pour obtenir des cristaux appropriés pour des études cristallographiques, la macromolécule (par exemple protéines, acides nucléiques, protéines-protéines complexes ou de protéines nucléiques complexes acide) doit être purifiée à l'homogénéité, ou aussi près que possible de l'homogénéité. L'homogénéité de la préparation est un facteur clé dans l'obtention de cristaux qui diffractent à haute résolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Cristallisation nécessite apportant la macromolécule à la sursaturation. L'échantillon devrait donc être concentré à la concentration la plus élevée possible sans causer d'agrégation ou une précipitation de la macromolécule (généralement 20 à 50 mg / mL). Présentation de l'échantillon à l'agent de précipitation peut favoriser la nucléation des cristaux de protéines dans la solution, qui peut résulter en grande en trois dimensions la croissance de cristaux de la solution. Il existe deux techniques principales pour obtenir des cristaux: la diffusion de vapeur et de la cristallisation par lots. Dans la diffusion de vapeur, une goutte contenant un mélange de solutions précipitant et de protéine est scellé dans une chambre avec précipitant pur. La vapeur d'eau diffuse alors hors de la baisse jusqu'à ce que l'osmolarité de la goutte et le précipitant sont égaux (figure 1A). La déshydratation de la chute provoque une lente concentration de protéines et de précipitant jusqu'à ce qu'un équilibre soit atteint, idéalement dans la zone de nucléation des cristaux du diagramme de phase. La méthode repose sur lots portant les protéines directement dans la zone de nucléation par la protéine de mélange avec la quantité appropriée de précipitant (figure 1B). Cette méthode est généralement réalisée sous une paraffine / mélange d'huile minérale afin de prévenir la diffusion de l'eau hors de la goutte.
Ici, nous allons montrer deux types de montage expérimental pour la diffusion de vapeur, goutte suspendue et déposer assis, en plus de la cristallisation par lots dans l'huile.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article nous décrire et démontrer générale protocoles actuels pour la cristallisation des protéines. Comme il une procédure en plusieurs étapes il ya quelques considérations, il faut être conscient. Lorsque vous travaillez avec de très petits volumes (0.5-2 uL), le séchage de la baisse due à l'évaporation est une préoccupation majeure. Par conséquent, il est recommandé de travailler dans un environnement bien contrôlé (avec faible débit d'air, une humidité élevée et un contrôle ri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une bourse de chercheur Burroughs Wellcome à YM et par une bourse de recherche postdoctorale Brown-Coxe de l'Université Yale à MD.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
Riferimenti
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