Cristallizzazione delle proteine per la cristallografia a raggi X
Summary
La struttura 3-D di una molecola fornisce una comprensione unica del funzionamento molecola. Il metodo principale per la determinazione della struttura a quasi atomico risoluzione è cristallografia a raggi X. Qui, dimostra i metodi attuali per ottenere cristalli tridimensionali di qualunque macromolecola dato che sono adatti per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi X.
Abstract
Utilizzando la struttura tridimensionale delle macromolecole biologiche di dedurre il loro funzionamento è uno dei più importanti campi della biologia moderna. La disponibilità di strutture risoluzione atomica fornisce una comprensione profonda e unica funzione della proteina, e aiuta a svelare i meccanismi interni della cellula vivente. Ad oggi, l'86% del Protein Data Bank (rcsb-PDB) le voci sono strutture macromolecolari che sono stati determinati con cristallografia a raggi X.
Per ottenere cristalli adatti per studi cristallografici, la macromolecola (ad esempio proteine, acidi nucleici, proteine-proteine o complessi di proteine-acidi nucleici complesso) deve essere purificato all'omogeneità, o il più vicino possibile alla omogeneità. L'omogeneità della preparazione è un fattore chiave per ottenere cristalli che diffrangere ad alta risoluzione (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Cristallizzazione richiede portando la macromolecola di sovrasaturazione. Il campione deve quindi essere concentrati per la massima concentrazione possibile, senza causare aggregazione o precipitazione della macromolecola (di solito 2-50 mg / mL). Presentazione del campione di agente precipitante in grado di promuovere la nucleazione dei cristalli di proteine nella soluzione, che può portare a grandi tridimensionali cristalli crescente dalla soluzione. Esistono due tecniche principali per ottenere cristalli: diffusione del vapore acqueo e cristallizzazione batch. Nella diffusione del vapore, una goccia contenente una miscela di soluzioni precipitante e proteine è sigillato in una camera con precipitante puro. Il vapore acqueo diffonde poi fuori della goccia fino alla osmolarità della goccia e il precipitante sono uguali (Figura 1A). La disidratazione della goccia provoca una lenta concentrazione di proteine e precipitante fino a quando l'equilibrio è raggiunto, idealmente nella zona di nucleazione cristallina del diagramma di fase. Il metodo si basa sul lotto portando la proteina direttamente nella zona di nucleazione da proteica con la giusta quantità di precipitante (Figura 1B). Questo metodo è di solito eseguita in una paraffina / miscela olio minerale per prevenire la diffusione di acqua dalla caduta.
Qui ci dimostrano due tipi di apparato sperimentale per la diffusione del vapore, appeso goccia e goccia seduti, oltre a cristallizzazione lotto sott'olio.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo articolo descrivere e dimostrare generali attuali protocolli per la cristallizzazione della proteina. Dal momento che un multi-step procedura ci sono alcune considerazioni bisogna essere a conoscenza. Quando si lavora con volumi molto piccoli (0,5-2 mL), essiccazione della caduta a causa dell'evaporazione è una preoccupazione importante. Pertanto, si raccomanda di lavorare in un ambiente ben controllato (con flusso aria bassa, alta umidità e controllo della temperatura stretto) e di adottare una tecnica …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato da una Investigator Award Burroughs Wellcome a YM e da un Brown-Coxe borsa post-dottorato presso la Yale University a MD.
Materials
| New Item | ||||
| Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
| 24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
| 24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
| Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
| Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
| 100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
| 1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
| 96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |
Riferimenti
- Bergfors, T. M. . Protein crystallization : techniques, strategies, and tips : a laboratory manual. , (1999).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J Biol Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- Dessau, M., Chamovitz, D. A., Hirsch, J. A. Expression, purification and crystallization of a PCI domain from the COP9 signalosome subunit 7 (CSN7). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 62, 1138-1140 (2006).
- Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M., Ladner, J. E. Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: new features, data and the NASA archive for protein crystal growth data. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 408-413 (1994).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J Appl Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Jancarik, J., Scott, W. G., Milligan, D. L., Koshland, D. E., Kim, S. H. Crystallization and preliminary X-ray diffraction study of the ligand-binding domain of the bacterial chemotaxis-mediating aspartate receptor of Salmonella typhimurium. J Mol Biol. 221, 31-34 (1991).
- Kimber, M. S., Vallee, F., Houston, S., Necakov, A., Skarina, T., Evdokimova, E., Beasley, S., Christendat, D., Savchenko, A., Arrowsmith, C. H. Data mining crystallization databases: knowledge-based approaches to optimize protein crystal screens. Proteins. 51, 562-568 (2003).
- Lorber, B., Sauter, C., Theobald-Dietrich, A., Moreno, A., Schellenberger, P., Robert, M. C., Capelle, B., Sanglier, S., Potier, N., Giege, R. Crystal growth of proteins, nucleic acids, and viruses in gels. Prog Biophys Mol Biol. 101, 13-25 (2009).
- McPherson, A. . Crystallization of biological macromolecules. , (1999).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Page, R., Grzechnik, S. K., Canaves, J. M., Spraggon, G., Kreusch, A., Kuhn, P., Stevens, R. C., Lesley, S. A. Shotgun crystallization strategy for structural genomics: an optimized two-tiered crystallization screen against the Thermotoga maritima proteome. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59, 1028-1037 (2003).
