In molte situazioni biologici e clinici è vantaggioso per lo studio dei processi cellulari, come si evolvono nel loro microambiente nativo. Qui si descrive il montaggio e l'uso di un basso costo in fibra ottica microscopio in grado di fornire immagini in tempo reale in coltura cellulare, studi su animali e studi clinici del paziente.
Molti studi biologici e clinici richiedono lo studio longitudinale e l'analisi della morfologia e funzione con risoluzione a livello cellulare. Tradizionalmente, gli esperimenti multipli sono in parallelo, con singoli campioni rimosso dallo studio in momenti sequenziali per la valutazione al microscopio ottico. Intravitale diverse tecniche sono state sviluppate, con confocale, multiphoton, e secondo microscopia armonica tutti dimostrando la loro capacità di essere utilizzato per l'imaging in situ 1. Con questi sistemi, tuttavia, la cosa è tecnicamente complessa e costosa, che coinvolgono i sistemi di scansione laser e complessi sorgenti luminose. Qui vi presentiamo un protocollo per la progettazione e l'assemblaggio di una ad alta risoluzione microendoscope che può essere costruita in un giorno con off-the-shelf componenti per meno di US $ 5.000. La piattaforma offre flessibilità in termini di risoluzione, campo di vista, e la lunghezza d'onda di funzionamento, e viene descritto come questi parametri possono essere facilmente modificato per soddisfare le esigenze specifiche dell'utente finale.
Noi e gli altri hanno esplorato l'utilizzo del microendoscope ad alta risoluzione (HRME) in coltura cellulare in vitro 2-5, di 6 asportato e tessuti animali che vivono 2,5, e nei tessuti umani in vivo 2,7. Gli utenti hanno segnalato l'uso di diversi agenti di contrasto fluorescente, tra cui proflavina 2-4, benzoporfirina derivate anello monoacid A (BPD-MA) 5, e fluoroscein 6,7, che hanno ricevuto pieno, o l'approvazione sperimentale da parte della FDA per l'uso in soggetti umani. Ad alta risoluzione microendoscopy, nella forma descritta qui, può fare appello ad una vasta gamma di ricercatori che lavorano nel campo delle scienze di base e clinica. La tecnica offre un approccio efficace ed economica che integra microscopia tradizionali da banco, permettendo all'utente di eseguire ad alta risoluzione, immagini longitudinale in situ.
La tecnica ad alta risoluzione microendoscopy qui descritta fornisce ricercatori nel campo della ricerca biomedica di base e clinica con un metodo flessibile, robusta e conveniente per la visualizzazione dei dettagli cellulari in situ. Abbiamo descritto un protocollo per il montaggio del sistema di imaging e dimostrato il suo impiego in colture cellulari in vitro e in animali e tessuti umani in vivo. Mentre i risultati delle immagini qui presentate proflavina usato come agente di contrasto fluorescente, altri gruppi hanno dimostrato le versioni del sistema di illuminazione a LED con lunghezze d'onda e filtri scelti per abbinare eccitazione / emissione spettri di altri coloranti 5-7.
Risoluzione e campo di vista sono inizialmente determinati dal core-to-core spaziatura e il diametro di imaging della fibra ottica fascio. Abbiamo utilizzato fasci di circa 4 micron nucleo-core spaziatura, l'imaging e diametri di 330 micron (filmato 1), 720 micron (Figura 2, Figura 3a, b), e 1400 micron (Figura 3c). I fasci più piccoli che possono essere passate aghi calibro più stretto e sono molto più flessibili rispetto alle fibre più grandi. Noi e gli altri 8 hanno, in alcuni casi, ha osservato la comparsa di emissioni di autofluorescenza dalla fibra stessa bundle. Quando si tenta di eccitare fluorofori a lunghezze d'onda UV, o raccogliere emissione nella gamma spettrale rosso, l'attenzione dovrebbe essere prestata al livello di autofluorescenza fascio di fibre che contribuiscono al segnale complessivo misurato.
Mentre la maggior parte del lavoro ad alta risoluzione microendoscopy segnalato fino ad oggi hanno utilizzato un fascio di fibre nudo, un ingrandimento extra può essere fornito da uso di lenti GRIN legato alla punta distale. Le lenti GRIN offrono un modo semplice ed economico per aumentare la risoluzione spaziale, anche se la loro suscettibilità alle aberrazioni ottiche e limitato NA è ben riconosciuta. Se l'obiettivo delle prestazioni GRIN è inadeguata per una particolare applicazione, GRIN ibrido / obiettivi lente sferica 9 o in miniatura assemblee lenti dell'obiettivo 10-11 può essere impiegato.
L'alta risoluzione microendoscope qui descritto essenzialmente funziona come un grande campo epi-microscopio a fluorescenza, quindi non sezionamento ottico (come in microscopia confocale o non lineare) deve essere previsto. Nella nostra esperienza, usando luce di eccitazione 455 nm e proflavina attualità come agente di contrasto, la luce è in primo luogo raccolto da una profondità corrispondente ad un paio di strati di cellule.
Questo protocollo deve permettere al lettore di assemblaggio ad alta risoluzione microendoscope sul bancone, con un ingombro compatto di 10 "x 8". Se lo si desidera, il sistema può essere racchiuso in una scatola ed i componenti elettrici (LED e telecamera) alimentato da un pacco batteria (Figura 1d). Molte fotocamere compatte può essere alimentato da IEEE-1394 (Firewire) e le porte USB del computer host.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata in parte finanziata dal National Institutes of Health, concedere R01 EB007594, il Dipartimento del Programma di Ricerca sul Cancro Seno Difesa, proposta BCO74699P7, e la Susan G. Komen Foundation concedere 26152/98188972.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |