Cultura Slice organotípicas de GFP-expressando embriões de camundongos para imagens em tempo real de crescimento dos nervos periféricos
Summary
Nós apresentamos um método para preparar fatias organotípicas de embriões meados de gestação do rato para a imagem de cultivo e de lapso de tempo de crescimento dos nervos periféricos.
Abstract
Para muitos propósitos, o cultivo de embriões de rato vivo ex como fatias organotípicas é desejável. Por exemplo, nós empregamos uma linha de camundongo transgênico (tauGFP) em que a versão melhorada da proteína verde fluorescente (EGFP) é exclusivamente expressa em todos os neurônios do desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico 1, permitindo a possibilidade de ambos os filmes a inervação o membro anterior e manipular esse processo com as técnicas farmacológicas e genéticas 2. O parâmetro mais crítico de sucesso no cultivo de culturas fatia tal é o método pelo qual as fatias são preparadas. Após extensos testes de uma variedade de métodos, descobrimos que um vibratome é o dispositivo melhor possível para cortar os embriões de tal forma que eles rotineiramente resultar em uma cultura que demonstra a viabilidade ao longo de um período de vários dias, e mais importante, se desenvolve em uma época forma específica. Para meados de gestação de embriões, o que inclui a consequência normal de nervos espinhais da medula espinhal e os gânglios da raiz dorsal para as suas metas na periferia e na determinação adequada do tecido ósseo e muscular.
Neste trabalho, apresentamos um método para processamento de embriões de todo dia embrionário (E) E10 a E12 em 300-400 fatias micrômetro para o cultivo em um padrão de cultura de tecidos da incubadora, que pode ser estudado por até dois dias após a preparação fatia. Crítico para o sucesso desta abordagem é o uso de um vibratome a fatia cada embrião agarose-embedded. Isto é seguido pelo cultivo das fatias em cima insere cultura Millicell membrana colocada sobre um pequeno volume de meio, resultando em uma técnica de cultura de interface. Uma maca com uma média de 7 embriões rotineiramente produz pelo menos 14 fatias (2-3 fatias da região forelimb por embrião), que varia um pouco devido à idade dos embriões, bem como para a espessura das fatias. Cerca de 80% das fatias cultivadas mostram crescimento do nervo, que pode ser medido longo de todo o período de 2 cultura. Resultados representativos usando a linha do mouse tauGFP são demonstradas.
Protocol
Discussion
Em uma extensa comparação de métodos para preparar culturas fatia embrionárias de embriões meados de gestação mouse (E10 – E12), temos observado que um vibratome produz, sem dúvida, os resultados mais confiáveis no que diz respeito a ambos os viabilidade global das culturas e da reprodutibilidade a conseqüência padrões nervosas. Em contraste, as fatias preparadas usando um helicóptero tecido McIlwain 3 mostrou-se completamente inviável. Nós originalmente empregado um método guilhotina <s…
Acknowledgements
Os autores agradecem a fonte original para a idéia de realizar cultura fatia em embriões de ratos 5. Gostaríamos de agradecer Joachim Kirsch ao apoio científico generoso e Degen Anna para agir como nosso gofer durante as filmagens. Este trabalho foi financiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) e da Universidade de Heidelberg (Redes de Excelência Cluster Cellular).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Riferimenti
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
