器官型切片文化绿色荧光蛋白表达的实时成像周围神经生长的小鼠胚胎
Summary
我们现在准备妊娠中期的小鼠胚胎的器官切片周围神经生长的培养和时间推移成像的方法。
Abstract
多种用途，小鼠胚胎体外培养器官切片是可取的。例如，我们采用了转基因小鼠线（tauGFP）在绿色荧光蛋白（EGFP）的增强版本是专门表示，在发展的中枢和外周神经系统1所有神经元的可能性，让这两个电影的支配前肢和操纵这个过程中，药理学和基因工程技术生产的 2 。切片文化的培育成功，最关键的参数，是这片准备的方法。多种方法进行广泛的测试后，我们发现一个vibratome设备切片胚胎等，他们经常在文化，展示了可行性的几天内，最重要的结果是最好的，在这样一个时代的发展特定的方式。对于妊娠中期的胚胎，这包括脊神经从脊髓和背根神经节，他们在外围和适当的骨骼和肌肉组织的决心目标的正常生长。
在这项工作中，我们提出了一种用于加工成300整个胚胎的胚胎一天（五）E10的E12的方法 – 种植400微米片在一个标准的组织文化的孵化器，可研究后切片准备两天。这种方法成功的关键是使用vibratome每个琼脂糖包埋胚胎切片。其次是种植后Millicell小文化膜插入后放在一个中等体积小，接口中的文化技术的切片。凋落物平均7胚胎常规生产，至少有14片（2-3片每胚胎前肢地区），由于胚胎的年龄以及切片厚度略有不同。大约80％的培养切片显示神经生长，它可以测量througout培养期2。使用tauGFP鼠标线的代表结果表明。
Protocol
Discussion
在比较广泛的方法，准备妊娠中期的小鼠胚胎的胚胎切片文化（E10 – E12），我们观察到一个vibratome毫无疑问，尊重文化的整体可行性和重复性生产的最可靠的结果神经生长模式。相比之下，使用斩波器3被证明是完全inviable一个McIlwain组织切片准备。我们原任一个断头台的方法4，在整个胚胎的垃圾可以同时缠一堑长一连续篦生产400 微米的第1钨丝切片准备。虽然这种技术已?…
Acknowledgements
作者承认的想法执行后，小鼠胚胎5片文化的原始来源。我们要感谢我们gofer在拍摄约阿希姆基尔希的慷慨科学支持和安娜德劲。这项工作是由德国研究基金会（德意志研究联合会：Sonderforschungsbereich 488 Teilprojekt B7/B9）和海德堡大学（卓越集群无线通信网络）。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Riferimenti
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
