Organotypische Slice Cultuur van GFP-expressie muis embryo's voor real-time beeldvorming van perifere zenuwen uitgroei

Summary

We presenteren een methode om organotypische plakjes van mid-dracht muis embryo's voor te bereiden op de teelt en de time-lapse imaging van perifere zenuwen uitgroei.

Abstract

Voor vele doeleinden, de teelt van muizenembryo's ex vivo als organotypische plakken is wenselijk. Bijvoorbeeld, gebruiken we een transgene muis lijn (tauGFP), waarin de uitgebreide versie van het groen fluorescerend eiwit (EGFP) uitsluitend wordt uitgedrukt in alle neuronen van de ontwikkelingslanden centraal en perifeer zenuwstelsel ^1, waardoor de mogelijkheid om zowel film als de innervatie van de voorpoot en om dit proces te manipuleren met farmacologische en genetische technieken ^2. De meest kritische parameter in de succesvolle teelt van dergelijke slice culturen is de methode waarmee de schijfjes worden bereid. Na uitgebreide testen van een verscheidenheid aan methoden, we hebben ontdekt dat een vibratome is de best mogelijke apparaat om de embryo's zodanig dat ze routinematig resulteren in een cultuur die levensvatbaarheid over een periode van enkele dagen, en vooral laat zien slice, ontwikkelt zich in een tijdperk -specifieke manier. Voor mid-zwangerschap embryo's omvat dit de normale uitgroei van de spinale zenuwen uit het ruggenmerg en de achterwortelganglia om hun doelen in de periferie en de juiste bepaling van de skelet-en spierweefsel.

In dit werk, presenteren we een methode voor het verwerken van hele embryo's van embryonale dag (E) E10 tot E12 in 300 tot 400 micrometer plakjes voor de teelt in een standaard weefselkweek incubator, die kunnen worden bestudeerd voor tot twee dagen na de slice voorbereiding. Cruciaal voor het succes van deze aanpak is het gebruik van een vibratome aan elk agarose-embedded embryo slice. Dit wordt gevolgd door de teelt van de schijfjes op Millicell cultuur membraan inserts geplaatst op een klein volume van het medium, wat resulteert in een interface cultuur techniek. Een nest met een gemiddelde van 7 embryo's produceert gewoonlijk minstens 14 sneetjes (2-3 plakjes van de voorpoot regio per embryo), die een beetje varieert vanwege de ouderdom van de embryo's en aan de dikte van de plakken. Ongeveer 80% van de gekweekte plakjes tonen zenuw uitgroei, die kan worden gemeten througout het kweken periode ^2. Representatieve resultaten met behulp van de muis tauGFP lijn worden gedemonstreerd.

Protocol

Deel 1: Voorbereiding voor het snijden en het kweken. Bereid 10-cm weefselkweek platen met het snijden van medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% foetaal runderserum, 0,5% glucose, 1 mM glutamine, 2,5 mM HEPES, pH 7,3) en 3-cm Millicell-CM 0.4-um cultuur membraan inserts en in de broedstoof bij 37 ° C te houden en 5% CO 2. Verwarm 4% een laag smeltpunt agarose in PBS in de magnetron en houdt het bij verhitting plaat, zodat het blijft op ongeveer 37 ° C. Vul 10-cm bacteriologische Petr…

Discussion

In een uitgebreide vergelijking van methoden voor het embryonale slice culturen van mid-dracht muis embryo's (E10 – E12) voor te bereiden, hebben we vastgesteld dat een vibratome produceert zonder twijfel de meest betrouwbare resultaten met betrekking tot zowel de algemene leefbaarheid van de culturen en de reproduceerbaarheid van de zenuw uitgroei patronen. In tegenstelling, plakjes bereid met behulp van een tissue McIlwain chopper ³ bleek te zijn volledig inviable. We oorspronkelijk in dienst een guillo…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
HBSS 10x		GIBCO	14180
Dissection tools		FST	various
L.M.P. agarose		Invitrogen	15517-022
Whatmann paper		Whatman Int.	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM		GIBCO	41966
FBS		GIBCO	10270-106
Pen Strep		GIBCO	15140
L-glutamine 100x		GIBCO	25030
Vibratome		Microm International GmbH	HM 650 V
Fluorescent microscope		Olympus	BX61WI
analySIS		Soft Imaging System
Millicell-CM inserts		Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates		Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406		Henkel	142580
Razor blades		Thermo Fisher	none
Dissecting microscope		Nikon	SMZ800
HEPES		Roth	9105.2
Glucose		Sigma	G7021
x4 objective		Olympus	PL series
x10 objective		Olympus	UPLFL –PH series
Filter		Olympus	U-MNIBA2
CCD camera		Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber		Leica	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171