Culture organotypique d'exprimant la GFP embryons de souris pour les images en temps réel d'excroissance des nerfs périphériques
Summary
Nous présentons une méthode pour préparer les tranches organotypiques d'embryons de souris mi-gestation pour la culture et de l'imagerie time-lapse d'excroissance des nerfs périphériques.
Abstract
Pour de nombreux usages, la culture de la souris ex vivo des embryons en tranches organotypiques est souhaitable. Par exemple, nous employons une lignée de souris transgéniques (tauGFP) dans lequel la version améliorée de la protéine fluorescente verte (EGFP) est exclusivement exprimé dans tous les neurones du système nerveux central en développement et périphérique 1, donnant la possibilité à la fois film de l'innervation du la patte avant et de manipuler ce processus avec des techniques pharmacologiques et génétiques 2. Le paramètre le plus critique dans la culture réussie des cultures tranche telle est la méthode par laquelle les tranches sont préparées. Après de nombreux essais sur une variété de méthodes, nous avons constaté qu'un vibratome est le meilleur dispositif possible de couper les embryons tels qu'ils systématiquement lieu à une culture qui démontre la viabilité sur une période de plusieurs jours, et surtout, se développe dans un âge de manière spécifique. Pour la mi-gestation d'embryons, ce qui inclut l'excroissance normale des nerfs rachidiens de la moelle épinière et les ganglions de la racine dorsale de leurs objectifs dans la périphérie et la détermination adéquate des tissus squelettiques et musculaires.
Dans ce travail, nous présentons une méthode pour le traitement des embryons entiers de jour embryonnaire (E) E10 à E12 dans 300 à 400 tranches micrométrique pour la culture dans une norme incubateur de culture tissulaire, ce qui peut être étudiée pour un maximum de deux jours après la préparation tranche. Critique pour le succès de cette approche est l'utilisation d'un vibratome de découper chaque embryon agarose embarqués. Elle est suivie par la culture des tranches sur les inserts de culture Millicell membrane placée sur un petit volume de milieu, résultant en une technique de culture de l'interface. Une litière avec une moyenne de 7 embryons produit régulièrement au moins 14 tranches (2-3 tranches de la région forelimb par embryon), qui varie légèrement en raison de l'âge des embryons ainsi que de l'épaisseur des tranches. Environ 80% des tranches de culture montrent prolongement nerveux, qui peut être mesurée througout les 2 période de culture. Les résultats représentatifs en utilisant la lignée de souris tauGFP sont démontrés.
Protocol
Discussion
Dans une comparaison approfondie des méthodes pour préparer des cultures tranche embryonnaire des embryons de souris mi-gestation (E10 – E12), nous avons observé qu'un vibratome produit sans doute les résultats les plus fiables en ce qui concerne à la fois à la viabilité globale de la culture et la reproductibilité des les modèles de prolongement nerveux. En revanche, les tranches préparés en utilisant un hachoir de tissu McIlwain 3 s'est révélée être totalement non viables. Nous avions…
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la source d'origine de l'idée d'effectuer la culture à la tranche de 5 embryons de souris. Nous tenons à remercier Joachim Kirsch pour le soutien scientifique et généreux Anna Degen pour agir comme notre Gofer pendant le tournage. Ce travail a été financé par la Fondation allemande de recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) et l'Université de Heidelberg (Excellence Cluster réseaux cellulaires).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Riferimenti
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
