Organotypic स्लाइस संस्कृति GFP परिधीय तंत्रिका परिणाम की वास्तविक समय इमेजिंग के लिए माउस भ्रूण व्यक्त
Summary
हम परिधीय तंत्रिका परिणाम की खेती और समय चूक इमेजिंग के लिए मध्य हमल माउस भ्रूण के organotypic स्लाइस तैयार करने की विधि प्रस्तुत करते हैं.
Abstract
कई प्रयोजनों के लिए, organotypic स्लाइस के रूप में माउस भ्रूण पूर्व vivo की खेती के लिए वांछनीय है. उदाहरण के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक माउस (tauGFP) लाइन में जो हरे रंग का फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EGFP) के बढ़ाया संस्करण विशेष रूप से विकासशील मध्य और परिधीय तंत्रिका प्रणाली 1 के सभी न्यूरॉन्स में व्यक्त किया है काम, दोनों फिल्म की innervation संभावना अनुमति forelimb और औषधीय और आनुवंशिक 2 तकनीकों के साथ इस प्रक्रिया में हेरफेर करने के लिए. ऐसे टुकड़ा संस्कृतियों की सफल खेती में सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर विधि है जिसके द्वारा स्लाइस तैयार कर रहे हैं. तरीकों की एक किस्म का व्यापक परीक्षण के बाद हमने पाया है कि एक vibratome सर्वोत्तम संभव डिवाइस के लिए ऐसी है कि वे नियमित रूप से एक संस्कृति है कि कई दिनों की अवधि में व्यवहार्यता, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह दर्शाता परिणाम भ्रूण टुकड़ा है, एक उम्र में विकसित विशिष्ट तरीके से. मध्य हमल भ्रूण के लिए, यह रीढ़ की हड्डी और पृष्ठीय रूट ganglia से परिधि और कंकाल और मांसपेशियों के ऊतकों के समुचित निर्धारण में अपने लक्ष्य के लिए रीढ़ की हड्डी में तंत्रिकाओं के सामान्य परिणाम शामिल हैं.
खेती के लिए एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर, जिसके लिए अध्ययन किया जा सकता है टुकड़ा तैयारी के बाद दो दिनों के लिए 400 सुक्ष्ममापी स्लाइस – इस काम में, हम (ई) E10 E12 के लिए 300 में भ्रूण दिन के पूरे भ्रूण प्रसंस्करण के लिए एक तरीका मौजूद है. इस दृष्टिकोण की सफलता के लिए क्रिटिकल एक vibratome का उपयोग करने के लिए प्रत्येक भ्रूण agarose – एम्बेडेड टुकड़ा है. यह Millicell संस्कृति झिल्ली माध्यम की एक छोटी मात्रा पर रखा आवेषण, एक अंतरफलक संस्कृति तकनीक में जिसके परिणामस्वरूप पर स्लाइस की खेती के द्वारा पीछा किया जाता है. 7 भ्रूण के एक औसत के साथ एक कूड़े नियमित रूप से कम से कम 14 (भ्रूण प्रति forelimb क्षेत्र के 2-3 स्लाइस) स्लाइस, जो भ्रूण की उम्र के कारण के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्लाइस की मोटाई के लिए थोड़ा भिन्न होता है पैदा करता है. सुसंस्कृत स्लाइस के बारे में 80% तंत्रिका परिणाम है, जो संवर्धन अवधि 2 througout मापा जा सकता है है दिखाते हैं. प्रतिनिधि tauGFP माउस लाइन का उपयोग कर परिणाम प्रदर्शन कर रहे हैं.
Protocol
Discussion
तरीकों की एक व्यापक तुलना मध्य हमल माउस भ्रूण भ्रूण टुकड़ा संस्कृतियों (E10 – E12) तैयार करने में, हम देखा है कि एक vibratome प्रश्न के बिना दोनों संस्कृतियों की समग्र व्यवहार्यता और के reproducibility के लिए सम्मान के साथ स?…
Acknowledgements
लेखकों माउस 5 भ्रूण पर टुकड़ा संस्कृति का प्रदर्शन करने के लिए विचार के लिए मूल स्रोत को स्वीकार करते हैं. हम उदार वैज्ञानिक समर्थन और अन्ना Degen के लिए शूटिंग के दौरान हमारे gofer के रूप में अभिनय के लिए Joachim Kirsch स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं. और हीडलबर्ग (उत्कृष्टता क्लस्टर सेलुलर नेटवर्क) विश्वविद्यालय: यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (488 Sonderforschungsbereich, B7/B9 Teilprojekt ड्यूश Forschungsgemeinschaft) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Riferimenti
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
