Organotypic Slice Kultur av GFP-uttryckande musembryon i realtid avbildning av perifera nerver utväxt

Summary

Vi presenterar en metod för att förbereda organotypic skivor mitt i dräktigheten musembryon för odling och tidsförlopp avbildning av perifera nerver utväxt.

Abstract

För många ändamål är odling av musembryon ex vivo som organotypic skivor önskvärt. Till exempel använder vi en transgen mus linje (tauGFP) där förbättrad version av det grönt fluorescerande protein (EGFP) är enbart uttrycks i alla nervceller i att utveckla centrala och perifera nervsystemet ^1, vilket gör det möjligt att både filma innervation av den forelimb och att manipulera denna process med farmakologiska och genetiska tekniker ^2. Den mest kritiska parametern i den framgångsrika odling av sådan skiva kulturer är den metod som skivorna är beredda. Efter omfattande tester av en mängd olika metoder, har vi funnit att en vibratome är den bästa möjliga enheten till skiva embryon så att de rutinmässigt resultera i en kultur som visar lönsamheten under en period av flera dagar, och viktigast, utvecklas i en ålder -specifika sätt. För mitt i dräktigheten embryon omfattar detta normalt utväxt av spinal nerver från ryggmärgen och dorsalrotsganglier till sina mål i periferin och en korrekt bestämning av skelett-och muskelvävnad.

I detta arbete presenterar vi en metod för behandling av hela embryon av embryonala dag (E) E10 till E12 till 300 till 400 mikrometer skivor för odling i en vanlig vävnadsodling inkubator, som kan studeras i upp till två dagar efter skiva beredning. Avgörande för framgången med denna metod är att använda en vibratome att skära varje agaros-inbäddade embryo. Detta följs av odlingen av de skivor på Millicell insatser kultur membran placeras på en liten volym av medium, vilket resulterade i ett gränssnitt kultur teknik. En kull med ett genomsnitt på 7 embryon ger rutinmässigt minst 14 skivor (2-3 skivor av forelimb regionen per embryot), som varierar något beroende på ålder embryon samt tjockleken på skivorna. Cirka 80% av den odlade skivor visar nerv utväxt, som kan mätas througout den odling period ^2. Representativa resultat genom att använda tauGFP musen linjen demonstreras.

Protocol

Del 1: Förberedelser för skivning och odling. Förbered 10-cm plattor vävnadsodling med skivning medium (DMEM, 25% 1x HBSS, 25% fetalt bovint serum, 0,5% glukos, 1 mM glutamin, 2,5 mm HEPES, pH 7,3) och 3-cm Millicell-CM 0.4-ìm kultur membran skär och hålla i inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2. Värm upp 4% låg smältpunkt agaros i PBS i mikrovågsugnen och hålla den på värmeplattan så att den stannar vid ca 37 ° C. Fyll 10-cm bakteriologiska petriskålar med PBS (140…

Discussion

I en omfattande jämförelse av metoder för att förbereda embryonala bit kultur mitt i dräktigheten musembryon (E10 – E12), har vi konstaterat att en vibratome producerar utan tvekan den mest tillförlitliga resultat med hänsyn till både den totala lönsamheten för kulturer och reproducerbarhet nerven utväxt mönster. Däremot beredd skivor med hjälp av en McIlwain vävnad chopper ³ visade sig vara helt inviable. Vi arbetar ursprungligen en giljotin metod ^4, där en hel kull av embryon kan …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
HBSS 10x		GIBCO	14180
Dissection tools		FST	various
L.M.P. agarose		Invitrogen	15517-022
Whatmann paper		Whatman Int.	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM		GIBCO	41966
FBS		GIBCO	10270-106
Pen Strep		GIBCO	15140
L-glutamine 100x		GIBCO	25030
Vibratome		Microm International GmbH	HM 650 V
Fluorescent microscope		Olympus	BX61WI
analySIS		Soft Imaging System
Millicell-CM inserts		Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates		Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406		Henkel	142580
Razor blades		Thermo Fisher	none
Dissecting microscope		Nikon	SMZ800
HEPES		Roth	9105.2
Glucose		Sigma	G7021
x4 objective		Olympus	PL series
x10 objective		Olympus	UPLFL –PH series
Filter		Olympus	U-MNIBA2
CCD camera		Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber		Leica	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171