Organotipik Dilim Kültür GFP-Periferik Sinir akıbet Gerçek zamanlı Görüntüleme Fare Embriyolar ifade

Summary

Biz periferik sinir akıbet ekimi ve zaman atlamalı görüntüleme için gebeliğin orta fare embriyo Organotipik dilim hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Abstract

Birçok amaç için, fare embriyoları ex vivo Organotipik dilimleri olarak ekimi arzu edilir. Örneğin, biz, hem filmin innervasyon imkanı sağlayan, yeşil flüoresan protein (EGFP) geliştirilmiş bir versiyonu sadece gelişmekte olan santral ve periferal sinir ^sistemi 1 bütün nöronlar ifade edildiği bir transgenik fare hattı (tauGFP) istihdam farmakolojik ve genetik teknikleri ile ² ön ayakları ve bu süreci yönetmek için. Böyle bir dilim kültürlerin başarılı yetiştiriciliğinde en kritik parametre dilimleri tarafından hazırlanan bir yöntemdir. Çeşitli yöntemler geniş test ettikten sonra, bir vibratome, onlar, birkaç günlük bir süre içinde canlılığını ve en önemlisi gösteren bir kültür rutin Sonuç olarak bu tür embriyoların dilim mümkün olan en iyi cihaz olduğunu bulduk, bir yaş gelişir özel bir şekilde. Gebeliğin orta embriyolar için, bu, omurilik ve dorsal kök gangliyon, çevre ve iskelet ve kas dokusu uygun belirlenmesi hedeflerine spinal sinirlerin normal akıbet içerir.

400 mikrometre dilim dilim hazırlandıktan sonra iki gün için çalışılan bir standart doku kültürü inkübatör, tarım için – Bu çalışmada, 300 içine (E) E10 E12 embriyonik gün bütün embriyolar işlenmesi için bir yöntem mevcut. Bu yaklaşımın başarısı için kritik her agaroz gömülü embriyo dilim vibratome kullanılmasıdır. Bu bir arayüz kültür tekniği ile sonuçlanan orta küçük bir hacim üzerine yerleştirilen Millicell kültür membran ekler, üzerine dilim ekimi tarafından takip edilmektedir. 7 embriyoların ortalama bir çöp rutin nedeniyle embriyoların yaşın yanı sıra dilimlerin kalınlığı biraz değişir en az 14 dilim (2-3 dilim embriyo başına ön ayakları bölgenin), üretir. Kültürlü dilim yaklaşık% 80'i, ^tüm kültür süresi 2 boyunca ölçülen sinir akıbet göstermektedir. TauGFP fare satırını kullanarak Temsilcisi sonuçlar gösterilmiştir.

Protocol

Bölüm 1: dilimleme ve kültür için hazırlanması. , Orta (DMEM 1x HBSS,% 25 fetal sığır serumu,% 0.5 glikoz, 1 mM glutamin, 2,5 mM Hepes, pH 7.3,% 25) ve 3 cm Millicell-CM 0.4 mikron kültür dilimleme 10 cm doku kültürü tabak hazırlayın membran ekler ve 37 ° inkübatör tutmak ° C ve% 5 CO 2. Yaklaşık 37 kalır böylece mikrodalga PBS içinde% 4 düşük erime noktası agaroz Isı ve ısıtma plakası tutmak ° C PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na 2</s…

Discussion

Gebeliğin orta fare embriyoları embriyonik dilim kültürleri (E10 – E12) hazırlamak için kapsamlı bir yöntem karşılaştırıldığında, biz bir vibratome soru kültürlerin genel uygulanabilirliği ve tekrarlanabilirliği hem açısından en güvenilir sonuçlar verdiğini gözlemledik sinir akıbet desenler. Buna karşılık, dilimler ³ tamamen inviable olduğunu kanıtladı McIlwain doku kıyıcı kullanılarak hazırlanmıştır. Biz aslında tüm embriyoların bir çöp eş zamanlı seri üretme…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
HBSS 10x		GIBCO	14180
Dissection tools		FST	various
L.M.P. agarose		Invitrogen	15517-022
Whatmann paper		Whatman Int.	3030917
Shortened firepolished pipettes
DMEM		GIBCO	41966
FBS		GIBCO	10270-106
Pen Strep		GIBCO	15140
L-glutamine 100x		GIBCO	25030
Vibratome		Microm International GmbH	HM 650 V
Fluorescent microscope		Olympus	BX61WI
analySIS		Soft Imaging System
Millicell-CM inserts		Millipore	PICMORG 50
10 cm culture plates		Greiner Bio-One	633171
LOCTITE 406		Henkel	142580
Razor blades		Thermo Fisher	none
Dissecting microscope		Nikon	SMZ800
HEPES		Roth	9105.2
Glucose		Sigma	G7021
x4 objective		Olympus	PL series
x10 objective		Olympus	UPLFL –PH series
Filter		Olympus	U-MNIBA2
CCD camera		Soft Imaging System	SIS F-View II
Equipment for heated chamber		Leica	CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171