Inledning Den moderna vetenskapliga insatser inom området biomedicin leda till praktisk nytta inklusive införandet av effektiva diagnosmetoder för infektionssjukdomar. Hög kvalitet och snabb diagnostik behövs på grund av risken för sjukdomsspridning grund av den globala resor och den nuvarande förödande effekterna av virus-och bakterieinfektioner i de drabbade fattiga områden i världen 1. I resurssvaga länder behandling av HIV-positiva patienter med antiretroviral terapi (ART) har framgångsrikt introducerats 2,3. Protokollen av ART närvarande grundar sig på (i) serologiska tester för HIV + individer, (ii) en gång dagligen kombinationer av genetiskt läkemedel regimer användas som "första linjens" ART och (iii) CD4 och / eller viralt analyser last att bestämma när du ska börja ART. Protokollen är dock förändras utrymmet för ART kan nu ytterligare breddas med mer avslappnad riktlinjer för att initiera ART tidigare vid högre CD4-tal 2. Viktigt är att öka antalet HIV + patienter som får ART vid högre CD4 + celler / mikroliter blod kan även bromsa spridningen av hiv, trots den nuvarande bristen av hivvaccin 4, 5. Således HIV-infektion är redo att bli en kronisk sjukdom i allt fler överlevande, som kräver organiserade medicin mer än någonsin men det dåliga tillståndet för laboratoriemedicin i Afrika fortfarande en barriär av effektiv hälso-och sjukvård 6. Det finns röster att betona att tillhandahållandet av kortsiktiga bidrag inte ger hållbara lösningar 7-9, och HIV-relaterade bidrag levereras av länder i väst vid den aktuella skalan kan inte fortsätta för evigt 8,9. Under 2008 USD 15.600 miljoner gick till aids-program i låg-och medelinkomstländer, och cirka 50% av dessa var från externa, inklusive nordamerikanska, källor. Den beräknade trender visar att dessa utgifter är att öka upp till 2-3 gånger högre nivå, och att epidemin kommer fortfarande att vara med oss i 2031 såvida det inte sker en förändring i den nuvarande övergripande strategi 9. Således afrikanska länder måste bidra genom bättre förebyggande av hiv och klokare kostnadsbesparingar 9. Här föreslår vi att den senaste uppfinningsrika "förebilder" för rutinarbete kommer att fastställas och införas i resurssvaga länder (exempelvis i Afrika eller Indien). Dessa är de områden i världen där forskarna lär dig att dra full nytta av den nuvarande internationella stödet och sedan att använda sina kunskaper för att ytterligare förbättra vardagliga tekniken genom att bidra till en global utveckling. I västerländsk medicin den diagnostiska verksamheten i stort akademiskt och sjukhus är ofta "departmentalized", dvs separat "zoner av intresse" kan finnas för de olika discipliner som leder till en splittring i hemato-, Viro-, retroviro-, bakteriell, sero- , immuno-och cytologiska laboratorier i stället för att genomföra en samlande strategi med hjälp av en minimal uppsättning av tvärvetenskapliga diagnostiska analyser i en smittsam-sjukdom laboratorium. Dessutom kan den diagnostiska tester också vara alltför komplicerat och kostsamt. Givetvis skulle dessa tjänster behöver samordnas bättre men dessa samlande ansträngningar är osannolikt att komma helt från västra håll. Följaktligen är den ledande laboratorier och institut, såsom National Health Laboratory Service (NHL-SA) i samarbete med University of Witwatersrand i Johannesburg, Sydafrika, inför en extra uppgift att ytterligare utveckla, modifiera, ny inriktning och förbättra sin kostnadseffektiv diagnostik baserad på modern teknik. I den aktuella videon vi beskriver flow-cytometrisk metoder för att övervaka antiretroviral behandling (ART) hos HIV-infekterade patienter. Denna teknik presenteras stegvis i sex moduler för en kombination av relevant hemato-, immun-och virologiska tester på ett enda rör, kombinerat med grundläggande intern kvalitetskontroll (QC) för att säkerställa reproducerbarhet test 10. Den använder sig av monoklonala antikroppar som används här är alla vetenskapligt helt etablerad. CD45 reagens för vita blodkroppar 11-13, tillsammans med CD4 att räkna upp "hjälpare" T-lymfocyter, som är de främsta målen för hiv 12-14. Det är en "konstruktiv trick" som i samma rör till CD38 aktivering markör upptäcks på CD8 + T-celler som hiv virus-load (VL) tillhörande analys 15-17. För att understryka det sydafrikanska bidrag, påpekar vi att dessa begrepp och deras kostnadseffektiva praktiska kombinationerna alla har arbetat i NHL-Wits samarbeten bygger på ledande västerländsk teknik 10,12,13,16,17. Dessa analyser utförs i kombination, kommer att behövas för en korrekt övervakning av patienter som genomgår långvarig ART. När kost-efficieNCY granskas, detta är samordnade flödes-cytometry teknik visat sig vara ekonomiskt 16,18,19. Dessa enrörs analyser representerar kostnadsbesparande över deras västerländska varianter och under liknande tester utförda av separata instrument och / eller genomföras som olika surrogat tester med andra metoder. Dessa besparingar är specificerade i diskussionen. För godkännande av detta i grunden bara teknik, som använder fyra färger flödescytometri i en enda rör, är det viktigt att visa de tekniska stegen i ett videoformat. Expert rådgivare, chefer laboratorium och beslutsfattare som bär skyldighet att fatta beslut om att införa modern medicinsk teknik ofta inte i stånd att se de senaste tekniska detaljerna som utförs i stora regionala laboratorier med enorma bördor arbetsbelastning. Därav denna video visar information om ny utveckling som har infört i Sydafrika för att optimera arbetsflödet för test> 1000 kliniska prover varje arbetsdag 10,13,16,17. Protokoll Flödescytometri Testerna utfördes av 4-färg flödescytometri men analyser kan även utföras med 2-färger i två parallella rör (se nedan). Beckman Coulter-XL-MCL, en flödescytometer av stabila Fluidics 21, används men samma teknik kan också tillämpas på andra cytometrar. Tekniken beskrivs hanterar stora dagliga arbetsbörda på ~ 800-1100 prover / dag 10,13. Modul 1: Sätt upp av instrument Dagens in-house underhåll städning utföra två gånger varje dag: vid start och efter avslutat sista patientprov. Detta omfattar spolning av vakuum linjer och förvärva Clenz (5% natriumhypoklorit, BC, Miami, FL). Dessutom är i slutet av varje 30-rör karusell Clenz och destillerat vatten gå igenom för att minimera protein uppbyggnad. Vid daglig start vakuum-och tryck värden kontrolleras. Det bekräftas att bakgrunden räknas vara acceptabel (<100 evenemang i 100 sek). Efter att ha kört de första blodprovet det konstateras att i en delmängd av slida vätska överföringar är <1%. Sedan laser inriktning och fluorescens känslighet övervakas dagligen använder ett urval av FlowCheck 21. Det har konstaterats att den genomsnittliga kanalnumren är konsekventa (500 ± 50) med en låg variation (halv topp CV värden <2%). Ersättningen är kontrolleras varje vecka, FlowSet pärlor ritas för att se om medelvärdet kanalen värden är inom 1% av de förinställda målvärden 22. Att visuellt bekräfta precision på Levey-Jennings tomter, den genomsnittliga siffrorna kanalen och halv topp variationskoefficient (HPCV) värden för de fyra Fluorescens kanaler (FL1-FL4) dagligen visas. Nästa riktigheten av CD4 bekräftas på två CD4 nivåer. Under en PLG-CD4 testa stabiliserade blod processkontroll (IMMUNOTROL) används den låga normala (450-700 CD4-celler / l) och låga nivåer (100-200 CD4 celler / l, beroende på parti, ref 23). Dessa Immunotrol värden måste vara inom 0,5 SD av medelvärdet med en% CV <5% enligt begäran från internationella BC-IQAP programmet 24, Storbritannien NEQAS 25 och AFREQAS 26. Det är viktigt att med dessa enkla organiserade åtgärder som visas i videon den robusta flödescytometrar kan upprätthålla den nödvändiga stabiliteten för både absolut cell räknas som CD4 test och fluorescensintensiteten mätningar används för att aktivera markören CD38. Denna stabilitet har nyligen dokumenterats i detalj 17 bekräftar tidigare studier med andra cytometrar 15,27. Under vecka underhåll listan mode data (LMD) filer arkiveras för framtida referens och det arkiverade materialet tas sedan bort från cytometern hårddisken. Månadstillsyn ingår rengöring av reagens behållare, slidan, clenz och tankar avfall. Karusellen-mode prov huvudet är rengjort medan alla filter är också bort och tvättas. Denna rengöring är också utvidgas till förberedelse stationer TQPrep och PrepPlus2 (BC, FL). Den pipetter används för manuell beredning är validerade in-house minst var 3 månader men om pipettering felaktighet misstänks pipetten omedelbart tas ur drift för korrigerande åtgärder. Sjätte månad underhållet är planerad av Beckman Coulter, SA. Modul 2: Förbereda prover För CD45/CD4 PanLeucogated tvåfärgade protokoll 5 Beckman Coulter FlowCARE kit 28 används i Lyse-no-wash förfarande (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL). Detta kit innehåller CD45-fluorescein-(FITC, grön) och CD4-fykoerytrin (PE, orange). Flow-Count pärlor 29 köps i lösvikt och läggs till spela en särskild operatör-vänliga rollen som känd numbers av pärlor i en känd volym är pipetteras på plats i provet 30. Detta görs med samma pipetteringen som används för att leverera den mängd blod. Således Bead diskonteringsränta (BCR) i det förväntade intervallet visar att pipettera i visst prov exakt sker, enligt beskrivningen i modul 3 nedan. Viktigt är här den enkla pipettering metod, kallad "framåt pipettering, fungerar bäst, förutsatt att pärla-och blod-volymer levereras med samma pipett och spets och med identiska hantering 30. Vi fann att vidarebefordra pipettering gav optimala övergripande enhetlighet mellan laboratorier, både med avseende på operatörer uppnå pipettering mål inom acceptabla toleranser och reproducerbarhet av upprepad dosering, mätt med co-variationskoefficienten (% CV) 10,31,32. Denna metod, som presenteras på lokal kongresser 32, har godkänts för användning enligt South African National Accreditation Scheme (SANAS, www.SANAS.co.za) riktlinjer. Denna BCR användning av pärlor skiljer sig från de andra volymetriska räkna metoder där oftast den frystorkade pärla produkt som BDS Trucount preparat används som innehåller ett känt antal pärlor. Dessa preparat är utmärkta för att dokumentera stabilitet Fluidics av flödet instrument Flow Count Rate (FCR) metoden 20,31. Ändå gör användningen av de färdiga pärlor, som innehåller rör tekniken mer komplicerad eftersom det här är det viktigt att leverera blodvolymen i dessa rör med yttersta absolut precision. Det är allmänt överens om att för detta ändamål endast "omvänd pipettering" teknik är acceptabel Följande gäller utbildning. Vår BCR metod är därför billigare, mer informativ, enklare och lättare att lära sig, som visas i videon. – I jämförelse med alternativa liknande metoder 10,31,32 Vi finner också att de operatörer som använder framåt pipettering är mindre benägna att aspirera prov i pipetten som med omvänd pipettering kan leda till både skador på inre mekanism och behovet av omkalibrering som är svårt på avlägsna platser. Vår BCR-metoden undanröjer också behovet av automatiserade pipettera system i små till medelstora laboratorier (List 1). De blodprov är alltid behandlas i klass II biologiskt skåp. För att undvika omfattande ljud under inspelningen, är videon visas en speaker-röst med säkra material utanför dessa skåp. Den PLG-CD4 förvärvet protokollet om cytometrar ger en tid att stanna vid en viss tid eller fortsätta att förvärva 5000 lymfocyter evenemang för att förbättra noggrannheten på prover med låg CD4. Modul 3: Bead diskonteringsränta (BCR) Övervakning pärla räkna priser (BCR) i vårt system eller varje kontroll provet beräknas enligt formeln pärla händelser / sek 10,13,30,32,33. De menar, SD och% CV värden används på ett kalkylblad för att generera en sekvens komplott för att identifiera BCR extremvärden 30. Dessa bekräftar optimal drift av de tre systemen för pipettering, bearbetning och analys kallas provberedning verifiering (SPV), tillämpas på både de prover pipetteras manuellt eller med hjälp av PrepPlus2 automatiserade pipettering instrument 10. Under förvärvet BCR resultaten direkt ses i realtid på skärmar. På BC cytometrar Medelvärdet BCR är 80 ± 5 händelser / sek. Vi visar att den avvikande BCR-s identifieras och kör innan patienten resultaten släpps. Beslutet-tree algoritm illustreras i figur 1 (se även ref.10). Instrument funktionsfel indikeras av fluktuationer i BCR då övervakas under längsgående precision verifiering (LPV) för att upptäcka pipettering trender, mönster och plötsliga förändringar 10. Fluidics precision verifiering (FPV) är ett valfritt internt förfarande där en enda utspädning av pärlor alikvoteras till 10 rör för seriell förvärvet att bekräfta tecken på fluidic instabilitet på en potentiellt missköter instrument 10. Modul 4: CD45 För rutinmässig absolut räknas i våra studier ett blodvärde analysator LH-750 (Beckman Coulter), kalibreras varje månad, används dagligen som en referens för vita blodkroppar räkna (WCC) mot vilket flödescytometrar jämförs. CD45-genererade KV-s på flödescytometrar också valideras varje dag jämfört med tre nivåer av stabiliserad Beckman Coulter 5C hela kontroller blodkroppar. Godtagbara gränser för WCC avtal mellan flödet CD45 räknas och full blod analysatorer räkna är <5% 10. Detta indikerar att när resursen begränsningarna är allvarligare då i vår tjänst än ett enda instrument, t.ex. en flödescytometer, verkar vara tillräcklig för att kliniskt lämpligt WCC inklusive CD4-tal. Vit cell differential räknar utförs på olika hematologiska analysatorer som skiljer, i synnerhet i bedömningen av monocyt räknas. Mönstret av differentierad CD45 uttrycket är en klassisk användning av flödesteknik för differentiella WCC 11,12, 34. Som flödescytometern som härrör CD45 KV och räknar differential har visat sig vara korrekt, exakt och robust, kan dessa rutinmässigt införlivas i PLG-CD4 testmetod och även göras tillgänglig för läkare utan extra kostnad. Onormal CD45 mönster noteras på CD45/side skingra tomter i PLG-CD4-protokollet och följas upp på ett målat blod film att föranleda ytterligare kliniska undersökningen. Metoden detekterar infektion (bakterier och virus), leukemi och lymfom både hiv-negativa och HIV + patienter 34, 35. Under en rutin laboratorium uppföljning HIV + patienter blodvärde är ofta inte begärs från hematologi laboratoriet. Därför onormala CD45 mönster diagnostik vid öppet observerats i prover som skickas för CD4-tal. En ytterligare fördel är att den exakta absoluta CD4 fortfarande kan göras, även hos patienter med fynd av leukemi eller lymfom i blodet 35. Flow CD45 är väl lämpad att standardisera hematologi. Den hematologiska instrument som skiljer sig avsevärt från varandra. Vi föreslår införandet av CD45-baserade flödescytometrisk kvalitetskontroll för de WBC skillnader för att jämföra och standardisera hematologiska analysatorer 10,36. Modul 5: CD4 Den PLG-CD4-protokollet infördes på Beckman Coulter XL program består av åtta dot-tomter. Av dessa 4 används för att bestämma CD4 och 4 för kvalitetsövervakning 12,13. Bland dessa, de två dot-tomter som visas i Figur 2 är viktiga. Alla vita blodkroppar identifieras med hjälp av CD45 och sidospridning (region En dot-plot 2), medan skräp, röda blodkroppar / spöken och trombocyter ignoreras. Den CD45 + händelser överförs sedan till dot-plot 3 där CD4 +-lymfocyter identifieras genom sitt ljusa CD4 uttryck och låg sidospridning (region C). Absolut CD4 + lymfocyter beräknas från antalet händelser i regionen C och WCC (i Flow Count kalibrering regionen F). Värdena för CD4% av lymfocyterna från region B dot-plot 2. Den starkt CD4 + T-lymfocyter och svagt CD4 + monocyter diskrimineras av CD4-fluorescensintensitet och har scatter utan behov av att använda en extra CD3-T-cell specifik antikropp i reagensen cocktail (över ref.13). Modul 6: CD8/CD38 CD8-CD38 färgning är en del av 4-färg färgning med CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD38-PC5. Det CD4/CD45 är samma som ovan (Flow Care PLG-CD4) och två extra reagenser läggas är CD8-ECD/CD38-PC5 17. Om en flödescytometer körs bara två färger, en extra slang läggas att utföra CD8-FITC/CD38-PE tvåfärgs färgning, med hjälp igen Lyse-no-wash förfarande (IMMUNOPREP, Beckman Coulter, FL). En gating strategi liknar CD4 används för att identifiera CD8 + T celler med CD8-ECD vs sidospridning (Figur 3). CD38 uttryck på CD8 + lymfocyter är inritad som enda parameter histogram av CD38-PC5 menar fluorescensintensitet (MFI) vs celltal 16,17. Den CD38 MFI-värden ritas sekventiellt för varje besök av samma patient. Det första besöket (före behandling) är "baseline" MFI värde som alla andra besök av samma person CD38 MFI jämförs 16. Reglage och instrument stabilitet som anges i modul 1 baseras på dagliga förvärv av Flow Kontrollera att övervaka laseruppriktning och spänningsstabilitet. Flow Set sätter färg ersättning för alla de fyra fluorescerande kanalerna (se ovan). Immunotrol är den "negativa" processtyrning prov. Det "positiva" kontroll är en av monocyter i normalt blod uttrycka 9 x 10 3 CD38-molekyler per cell, och en känd HIV + prov obehandlat 17. Nätverket av den sydafrikanska National Health Laboratory Service (SA-NHL) laboratorier har antagit kvalitetskontroll metoder standardiseras i hela 70 laboratorier 13, 33 med en centraliserad databas med standardrutiner och utbildningsmaterial. Laboratorier i nätverket får hjälp av diskussioner, fortbildning och regelbundna audition inklusive granskning av pipettering teknik 32,33. Det kvalitetsbedömning programmet följs varje månad. På detta sätt är kvalitetsstyrning delegerats regionalt men hög standard upprätthålls med bidrag från SA-NHL QA avdelning 13, 26. Lista 1 potentiell kostnadsminskning med samordnad Cytometry i HIV-sjukdom.: Användningen av ett enda instrument med förtrogenhet och servicekontrakt, i stället för APtrafikerar flera hematologiska, immunologiska och virologiska instrument Utförandet av tester i en enda rör, utan extra kostnader och utan att skicka prover till och från olika platser både WCC, WBC differens räknas CD4 test och CD38MFI övervakning för att förutsäga svar på ART Omedelbar rapportering av svar på ART med CD38 MFI rapportering, att avsevärt förbättra handläggningstider i förhållande till traditionella hiv VL rapportering (i realtid) Den tydlighet och kliniska användningen av den kombinerade utvärdering av resultaten på samma rapportformulären Behovet av automatisk pipettering instrument kan förnekas som enkel metod för "framåt-pipettering" används och proverna övervakas av BCR, Under drift är felaktig hantering av prover identifieras och de problematiska testresultaten åtgärdas innan resultaten är auktoriserade Proaktiv förebyggande hantering av instrument för fel som leder till tidig tjänsten bokningen före en svår krasch Diagnos oanade fall av leukemi / lymfom under rutinmässiga service-verksamheten Förlängning av liknande flödesteknik för leukemi fenotypning och övervakning Samordning av CD38 testet med lagring av torkat blod fläckar (DBS) för HIV VL testning hos alla patienter och spara kostnader genom att skicka DBS för utvärdering endast om det finns kliniska eller CD38 indikationer att göra det Liknande flödesteknik att ersätta interferon-γ ELISPOT metod i tuberkulos analyser Kvalitetskontroll för perifera laboratorier som utför "point-of-care" CD4 test Spara kostnader för "oönskade" reagens som antikroppar mot CD3 och markörer delmängd (men köp CD38 istället) Inköp av billiga pärlor för BCR testning (istället för att köpa dyra före pipetteras räkna-rör) I ett nätverk, gemensamma förhandlingar för förmånliga bulk priser med kommersiella företag Figur 1. Ett beslut träd / algoritm som används när ett prov som testas visar ett avvikande resultat av pärla diskonteringsränta (BCR). Den viktigaste uppgiften är att utesluta pipettering fel kontra intermittenta volymetrisk misslyckande. Diagrammet visar sannolika orsaker till fel. Det är också visat att vilket protokoll histogram och statistik påverkas 10. Figur 2 Ett exempel på PLG CD4-protokoll som innefattar CD45-FITC (grön, x-axeln). Vs sidospridning (komplexitet, y-axel) och CD4-PE, (orange, X-axel) jämfört sidospridning ( komplexitet, y-axel). Grinden "A" är den totala vita cellpopulation med den valda porten av lymfocyter "B". Grinden "A" överförs till det andra diagrammet till höger för att identifiera de CD4 +-lymfocyter i grind "C". Figur 3 Kombinationen av CD45/CD4 panleucogating analysen. (I diagram 2 "och 3", se även Fig. 2) med CD8/CD38 analysen (i diagram 4 "och '6). När den totala leukocyter (port A) överförs till diagram 4 ", här CD8 + lymfocyter är gated på grundval av CD8-ECD (" x'-axeln) och sidospridning ("y'-axel, som visas i grind "D"). Då CD8 + celler överförs till diagram 6 för att visualisera CD38-PC5 färgningsintensitet i en enda parameter diagram. Detta visas som parameter "G" i diagram 6 ". Den genomsnittliga fluorescens CD38-PC5 intensitet (MFI) registreras. På ART detta värde minskar gradvis 16,17.