Realtid avbildning av Leukotriene B 4 Medierad Cell Migration och BLT1 Interaktioner med β-arrestin
Summary
Detta dokument beskriver metodiken för att fastställa kemotaxi svar av leukocyter till specifika ligander och identifiera interaktioner mellan receptorer på cellens yta och cytosola proteiner använder levande tekniker cell imaging.
Abstract
G-proteinkopplade receptorer (GPCRs) hör till de sju transmembrana proteinet familj och förmedlar transduktion av extracellulära signaler till intracellulära svar. GPCRs styra olika biologiska funktioner som kemotaxi, intracellulär kalcium release, genreglering i en ligand beroende sätt via heterotrimeric G-proteiner 1-2. Ligandbindande inducerar en serie konformationsanalys förändringar som leder till aktivering av heterotrimeric G-proteiner som modulerar nivåerna av andra budbärare som cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP), inositol trifosfat (IP3) och diacyl glycerol (GD). Samtidig med aktivering av receptorn ligandbindande initierar också en rad evenemang för att dämpa receptor signalering via hyposensibilisering, kvarstad och / eller internationalisering. Den hyposensibilisering process GPCRs sker via receptorn fosforylering av G-protein receptor kinaser (GRKs) och senare bindning av β-arrestins 3. β-arrestins är cytosoliskt proteiner och translocate till membran på GPCR aktivering, bindning till fosforylerat receptorer (oftast) det genom att underlätta receptor internalisering 4-6.
Leukotrien B 4 (LTB 4) är ett pro-inflammatoriska lipid molekyl från arakidonsyra vägen och förmedlar sina åtgärder via GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1, en hög affinitet receptor) och LTB 4 receptor 2 (BLT2, en låg affinitet receptor ) 7-9. LTB 4-BLT1 vägen har visat sig vara kritiska i flera inflammatoriska sjukdomar inklusive astma, ledgångsreumatism och åderförkalkning 10-17. Den aktuella artikeln beskriver de metoder som utvecklats för att övervaka LTB 4-inducerad leukocytmigration och växelverkan av BLT1 med β-arrestin och receptor translokation i levande celler med hjälp av tekniker mikroskopi avbildning 18-19.
Benmärg härrör dendritiska celler från C57BL / 6 möss var isolerade och odlade som tidigare beskrivits 20-21. Dessa celler testades i levande metoder cell imaging att visa LTB 4 inducerad cell migration. Den mänskliga BLT1 var märkta med röd fluorescerande protein (BLT1-RFP) vid C-terminus och β-arrestin1 märkta med grönt fluorescerande protein (β-ank-GFP) och transfekterade de båda plasmider i Rat basofila Leukomia (RBL-2H3) cellinjer 18-19. Kinetiken för samspelet mellan dessa proteiner och lokalisering övervakades använder levande mikroskopi cell video. De metoder som i den aktuella papper beskriver användningen av mikroskopiska tekniker för att undersöka den funktionella svar på G-proteinkopplade receptorer i levande celler. Den aktuella artikeln beskriver också användandet av metamorfa programvara för att kvantifiera fluorescens intensitet att bestämma kinetik receptorn och cytosola interaktioner protein.
Protocol
Discussion
Levande cell imaging är ett kraftfullt verktyg för att demonstrera funktionen och interaktioner av specifika proteiner när de inträffar i realtid. De metoder som beskrivs i detta manuskript visar tydligt att LTB 4 kan inducera en snabb migration av dendritiska celler. Dessa metoder inte bara bygga ut delar av LTB 4 funktion till olika celltyper, de tillåter liknande metoder som skall tillämpas på en mängd andra kemokiner och testa deras effektivitet som kemotaxi agenter på olika leukocyt s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen stöds av National Institutes of Health bidrag AI-52.381, CA138623 och Kentucky Lung Cancer Research Board och institutionellt stöd från James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
Riferimenti
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- . Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, . Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
