A capacidade de produzir transgenes para<em> Caenorhabditis elegans</em> Usando DNA genômico realizado por fosmids é particularmente atraente como todos os elementos nativos reguladoras são retidos. Descrito é um procedimento simples e robusto para a produção de transgenes via recombineering com o<em> GalK</em> Marcador selecionável.
A criação de animais transgênicos é amplamente utilizada em C. elegans pesquisa, incluindo o uso de proteínas de fusão GFP para estudar a regulação e padrão de expressão de genes de interesse ou de geração de conjunto de purificação de afinidade (TAP) com a tag versões de genes específicos para facilitar a sua purificação. Tipicamente transgenes são gerados pela colocação de um promotor a montante de um gene repórter GFP ou cDNA de interesse, e isso muitas vezes produz um padrão de expressão representativa. No entanto, elementos críticos da regulação de genes, como elementos de controle na região não traduzida 3 'ou promotores alternativos, podem ser perdidos por esta abordagem. Mais apenas uma variante única emenda pode ser geralmente estudado por este meio. Em contraste, o uso de DNA genômico verme transportado por clones DNA fosmid provavelmente inclui a maioria se não todos os elementos envolvidos na regulação de genes in vivo que permite a maior capacidade de capturar o padrão de expressão genuína e timing. Para facilitar a geração de transgenes usando DNA fosmid, descrevemos um E. coli baseado recombineering procedimento para inserir GFP, a TAP tag, ou outras seqüências de interesse em qualquer local do gene. O procedimento utiliza o gene galK como o marcador de seleção para as duas etapas de seleção positiva e negativa em recombineering o que resulta na obtenção da modificação desejada com alta eficiência. Além disso, plasmídeos contendo o gene galK ladeado por braços homologia com GFP comumente usados e TAP genes de fusão estão disponíveis que reduzem o custo de oligos em 50% ao gerar um GFP, ou proteína de fusão TAP. Estes plasmídeos use a origem de replicação R6K que impede a necessidade de purificação extensa produto da PCR. Finalmente, também demonstram uma técnica para integrar o marcador unc-119 para o backbone fosmid que permite que o fosmid a ser injetado diretamente ou bombardeados em vermes para gerar animais transgênicos. Este vídeo demonstra os procedimentos envolvidos na geração de um transgene através recombineering utilizando este método.
A geração de transgenes de fosmids oferece o benefício de manter todos os elementos promotor nativo, splice variantes, e três elementos 'UTR de regulamentação. Isso pode levar à construção de um transgene que é mais um reflexo do padrão de expressão nativa, ou a construção de um transgene funcional quando outras abordagens não 5. Os transgenes resultante pode carregar uma variedade de etiquetas de epítopo incluindo GFP ou um tag TAP.
A construção de transgene…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Lindsey Nash para ajudar a desenvolver a técnica. Este trabalho foi financiado pelo NIH conceder AG028977 a ALF, uma bolsa de projeto piloto da Universidade de Pittsburgh OAIC (AG024827), e fundos de sementes da Universidade de Pittsburgh.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
FosmidMAX kit | Epicentre | FMAX046 | ||
GoTaq | Promega | M7122 | ||
MOPS Media | Teknova | M2120 | ||
0.132 M Potassium phosphate solution | Teknova | M2102 | ||
D-galactose | Sigma | G0750 | ||
2-deoxygalactose | Sigma | D4407 | ||
Biotin | Sigma | B4639 | ||
Leucine | Sigma | L8000 | ||
NH4Cl | Sigma | A9434 | ||
Phusion DNA polymerase | NEB | F-530S | ||
MacConkey agar base | Becton Dickinson | 281810 | ||
Arabinose | Sigma | A3131 | ||
Chloramphenicol | Sigma | C1919 | ||
Sodium phosphate dibasic | Sigma | S5136 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Sodium chloride | Sigma | S5886 | ||
Glycerol | Sigma | G2025 | ||
Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 |