Analisi delle cellule staminali pluripotenti utilizzando criosezioni di corpi embrionali
Summary
Le cellule staminali pluripotenti in crescita in sospensione differenziarsi in corpi embrionali (EBS). Qui mostriamo come ottenere criosezioni EB alta qualità utile per lo studio di aspetti cellulari e molecolari della embriogenesi, pur mantenendo la propria organizzazione come aggregati.
Abstract
Staminali embrionali (ES), le cellule sono cellule pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna della blastocisti, stadio embrioni precoci di mammifero 1. Una fase cruciale nella differenziazione delle cellule staminali embrionali è la formazione di corpi embrionali (EBS) aggregati 2, 3. Formazione di EB è basato su aggregazione spontanea quando le cellule ES sono coltivate in piastre non aderente. Tridimensionale ricapitola EB molti aspetti dei primi embriogenesi dei mammiferi e di differenziarsi nei tre foglietti embrionali: ectoderma, mesoderma ed endoderma 4.
Immunofluorescenza e ibridazione in situ sono ampiamente utilizzate tecniche per la rilevazione di proteine bersaglio e di mRNA presenti nelle cellule di una sezione di tessuto 5, 6, 7. Qui vi presentiamo una semplice tecnica per generare criosezioni alta qualità dei corpi embrionali. Questo approccio si basa su l'orientamento spaziale di incorporare EB in ottobre seguita dalla tecnica cryosection. Le sezioni risultante può essere sottoposto a una vasta gamma di procedure analitiche per caratterizzare popolazioni di cellule che contengono alcune proteine, RNA o DNA. In questo senso, la preparazione di criosezioni EB (10μm) sono strumenti essenziali per l'analisi colorazione istologia (ad esempio Hematoxilin e eosina, DAPI), immunofluorescenza (ad esempio Oct4, nestina) o ibridazione in situ. Questa tecnica può anche aiutare a capire gli aspetti della embriogenesi per quanto riguarda il mantenimento del tri-dimensionale struttura sferica di EBS.
Protocol
Discussion
Il metodo qui descritto fornisce un facile da seguire il protocollo di ottenere PFA fisso criostato sezioni sottili di corpi embrionali utili per immunofluorescenza e saggi di ibridazione in situ. Il criosezioni risultante permesso lo studio degli aspetti cellulari e molecolari del differenziamento delle cellule staminali embrionali umane, pur mantenendo la loro struttura e organizzazione come aggregati.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fundação de Amparo uno Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq) e Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia (INCTC). Siamo grati a S. Bruna Paulsen e Aline M. Fernandes per le immagini EB.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
Riferimenti
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