Embryoid 기관의 Cryosections를 사용하여 Pluripotent 줄기 세포 분석
Summary
정지 성장 Pluripotent 줄기 세포가 embryoid기구 (EBS)에 구별. 집합체로 조직을 보존하면서 여기에서 우리는 embryogenesis의 세포 및 분자 측면을 연구하는 데 유용 고품질 EB의 cryosections를 얻는 방법을 보여줍니다.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포가 blastocyst 단계 초기 포유류의 배아 1의 내부 세포 덩어리에서 파생된 pluripotent 세포 수 있습니다. ES 세포의 분화에 중요한 단계는 embryoid 기관의 형성 (EBS) 집계 2, 3입니다. ES 세포가 아닌 자기편 접시에서 양식 때 EB의 형성은 자연 집합을 기반으로합니다. ectoderm, mesoderm 및 endoderm 4 : 입체 EB의 recapitulates 많은 초기 포유류의 embryogenesis의 측면 및 세 세균 층에 구별.
Immunofluorescence 및 현장 하이브리드화에 널리 조직 제 5, 6, 7 세포에있는 목표 단백질 및 mRNA의 검출 기술을 사용합니다. 여기 embryoid 기관의 고품질 cryosections를 생성하는 간단한 기술을 제시한다. 이러한 접근 방식은 OCT에서 EB의 포함의 공간적 방향 cryosection 기술 다음에 의존합니다. 그 결과 섹션은 특정 단백질, RNA 또는 DNA를 포함한 세포의 인구를 특성화하기 위해 분석 절차의 다양한 받게 수 있습니다. 이러한 의미에서, EB cryosections의 준비 (10μm)은 조직학 얼룩의 분석을위한 필수 도구 (예 : Hematoxilin과 Eosin, DAPI), immunofluorescence (예 : Oct4, nestin) 또는 현장 하이브리드화에 있습니다. 이 기술은 또한 EBS의 트라이 차원 구면 구조의 유지 보수 관련하여 embryogenesis의 측면을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
Discussion
방법은 여기에 설명된 것은 제공하는 쉬운 따라 immunofluorescence 및 현장 하이브리드화 assays에 유용 embryoid 기관의 PFA 고정 얇은 그라 이오 스탯 섹션을 얻기 위해 프로토콜을. 집합체로서의 구조와 조직을 보존하면서 결과 cryosections은 인간 배아 줄기 세포의 분화의 세포 및 분자 측면의 연구를 허용합니다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Fundação 드 Amparo에 의해 지원되었다 Pesquisa 에스타도하나요 리우데 자네이루 (FAPERJ), Conselho 나셔널 드 Desenvolvimento Científico 전자 Tecnológico (CNPq)과 Instituto 나셔널 드 Ciência E Tecnologia (INCTC). 우리는 브루나 S. 폴슨과 EB의 이미지 앨린 M. 페르난데스에게 감사하고 있습니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| D (+) Sucrose | Reagent | Vetec | 228 | |
| Paraformaldehyde | Reagent | Rieden-de Haën | 16005 | |
| PBS solution | Reagent | LGC Biotecnology | 13-30259.05 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma | P2636 | 200mg/mL in water |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Reagent | Sakura | P2636 | |
| Sucrose Solution | Reagent | 10% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 20% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Sucrose Solution | Reagent | 30% Sucrose Solution in PBS w/v | ||
| Conic Tube | Tool | TPP | 91015 | 15mL conic tube |
| Plate shaker | Tool | Biomixer | ||
| Cryostat | Tool | Leica | CM 1850 | |
| Mold for OCT platform | Tool | Plastic mold plataform |
Riferimenti
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