Beyin ve Omurilik Mononükleer Hücreleri İzolasyon Percoll Degradeler
Summary
Mevcut makalede, verimli, etkin bir şekilde akışını sitometrik analizler için kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.
Abstract
İzolasyon, enfeksiyon, travma, otoimmünite veya nörodejenerasyon sırasında santral sinir sistemi (MSS) sızmak bağışıklık hücreleri, sık sık fenotip ve efektör fonksiyonları tanımlamak için gereklidir. Histokimyasal yaklaşımlar infiltre hücrelerin yerini belirlemek ve patoloji ilişkili MSS analiz etmek için enstrümantal. Ancak, in-situ histokimyası ve immunofluorescent boyama teknikleri belirli bir doku immün hücre alt tiplerinin karakterize etmek için bir kez kullanılabilir antikor sayısı ile sınırlıdır. Bu nedenle, bağışıklık fenotipleme flow sitometri ile birlikte histolojik yaklaşımlar tamamen yerel MSS infiltrasyon kompozisyon karakterize etmek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, süreksiz Percoll gradyanları üzerinde MSS hücresel süspansiyonlar ayrılması dayanmaktadır. Mevcut makalede, verimli, flow sitometri ile tek bir örnek, çeşitli bağışıklık hücre popülasyonlarının belirlenmesi için etkin bir şekilde kullanılabilir beyin ve omurilik dokularında mononükleer hücreleri izole etmek için hızlı bir protokol tanımlamaktadır.
Protocol
Discussion
1-3 birkaç on yıl için, normal ve iltihaplı fare dokulardan MSS lökosit hücre yüzey belirteçlerinin analizi kullanılmıştır . İzolasyon protokolleri yoğunluğu santrifüj 4 mikroglia ve lökositlerin ayrılık dayanır. Burada izole MSS lökosit süreksiz Percoll gradyanlar kullanarak hızlı ve etkin bir yöntem açıklanmaktadır. , CD4, CD8, CD11b, CD19, vb gibi çeşitli antikorlar ile boyanarak hücre izolasyonu sonra, as-ama-CD45 sınırlı değil, belirli bir patoloji indüksiyo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Multipl Skleroz Derneği (TA AEC 3021-A1 / T) ve University of Texas at San Antonio tarafından desteklenmiştir.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
- Percoll (Amersham)
- 10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
- RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
- 7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
- Cell Staining Buffer (Biolegend)
- Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
- Hemacytometer (Fisher)
- Anti-mouse CD45 (clone 30-F11), CD4 (clone RM4-5), CD19 (clone 6D5), BioLegend
- 10X Phosphate Buffered Saline, without Calcium and Magnesium (Thermo Scientific)
- Paraformaldehyde (Sigma Aldrich)
- Flow cytometry analysis performed with a LSR II (BD Biosciences)
Riferimenti
- Sedgwick, J. D. Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88, 7438-7442 (1991).
- Ponomarev, E. D., Shriver, L. P., Maresz, K., Dittel, B. N. Microglial cell activation and proliferation precedes the onset of CNS autoimmunity. J. Neurosci. Res. 81, 374-389 (2005).
- Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared. J Immunol. 154, 4309-4321 (1995).
- Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Juedes, A. E., Ruddle, N. H. Resident and infiltrating central nervous system APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune encephalomyelitis. J. Immunol. 166, 5168-5175 (2001).
- Prinz, M., Priller, J. Tickets to the brain: Role of CCR2 and CX(3)CR1 in myeloid cell entry in the CNS. J Neuroimmunol. , (2010).
- Mildner, A. Microglia in the adult brain arise from Ly-6ChiCCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nat. Neurosci. 10, 1544-1553 (2007).
- Djukic, M. Circulating monocytes engraft in the brain, differentiate into microglia and contribute to the pathology following meningitis in mice. Brain. 129, 2394-2403 (2006).
