في الجسم الحي والدراسات في المختبر من محول - clathrin التفاعل
Summary
Clathrin بوساطة الإلتقام يعتمد على البروتينات التي تنسق محول اختيار البضائع وclathrin التجمع معطف. نحن هنا وصف لدراسة الإجراءات محول clathrin التفاعل الجسدي والتصوير الخلية الحية باستخدام النهج نموذجا الخميرة البروتين محول التقامي Sla1p.
Abstract
ومسارا رئيسيا التقامي يبدأ مع تشكيل clathrin الحويصلات المغلفة (CCVs) أن نقل البضائع من سطح الخلية لالإندوسومات 1-6. وتتميز CCVs بواسطة شعرية متعددة السطوح من المعاطف التي clathrin غشاء الحويصلة وبمثابة سقالة الميكانيكية. ويتم تجميع المعاطف Clathrin خلال تشكيل حويصلة من triskelia clathrin الفردية ، النموذج القابل للذوبان من clathrin تتألف من ثلاثة الثقيلة وثلاث مفارز ضوء سلسلة 7،8. لأن triskelion لا يملك القدرة على ربط الغشاء مباشرة ، clathrin ملزم محولات حاسمة لربط شعرية تشكيل clathrin إلى غشاء من خلال الجمعيات مع الدهون و / أو بروتينات غشاء 9. مهايئات عبر الغشاء أيضا شحن حزمة البروتين ، مثل المستقبلات ، ويمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض ومع المكونات الأخرى لتشكيل لجنة تنسيق المفردات آلات 9.
وقد وصفت أكثر من عشرين محولات clathrin ، وتشارك في عدة بوساطة الإلتقام clathrin وغيرها توطين لشبكة جولجي أو عبر الإندوسومات 9. باستثناء HIP1R (Sla2p الخميرة) ، وكلها معروفة clathrin محولات ربط المحطة المجال N – – المروحة من السلسلة الثقيلة clathrin 9. محولات Clathrin هي بروتينات وحدات تتألف من المجالات مطوية متصلة بواسطة linkers مرنة غير منظم. رابط داخل هذه المناطق ، زخارف ملزمة قصيرة التوسط التفاعلات مع المجال N – محطة clathrin أو المكونات الأخرى لتشكيل حويصلة آلات 9. وقد تم تحديد متميزتين clathrin ملزم الزخارف : clathrin مربع وعلى W – 9 مربع. وقد عرفت أصلا الآراء clathrin علبة تسلسل كما L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] (10) ولكن تم اكتشافها في وقت لاحق المتغيرات 11. وW – مربع يتفق مع تسلسل PWxxW (حيث x هو أي مخلفات).
وحددت أصلا Sla1p (القاتل الاصطناعية مع ملزم أكتين 1 – البروتين) باعتبارها بروتين يرتبط أكتين وضروري لبنية الهيكل الخلوي أكتين العادي وديناميكية في مواقع التقامي في خلايا الخميرة 12. Sla1p يربط أيضا إشارة NPFxD التقامي والفرز هو أمر حاسم لالإلتقام من البضائع التي تحمل إشارة NPFxD 13،14. ووصف في الآونة الأخيرة ، وقد تجلى Sla1p ربط clathrin من خلال فكرة مماثلة لصندوق clathrin ، LLDLQ ، متغير clathrin علبة (VCB) ، وتعمل كما هو محول an clathrin التقامي 15. بالإضافة إلى ذلك ، أصبحت علامة Sla1p المستخدمة على نطاق واسع للمعطف التقامي في دراسات الخلايا الحية المجهري مضان 16. هنا نستخدم Sla1p نموذجا لوصف النهج للدراسات التفاعل محول clathrin. ونحن نركز على العيش الخلية المجهر مضان ، GST – المنسدلة ، وأساليب التعاون مناعي.
Protocol
Discussion
Clathrin الحويصلات المغلفة (CCV) المشاركة في الإلتقام والنقل من الشبكة عبر وغولجي الإندوسومات ، مسارات الحفظ التي تعتبر أساسية في بيولوجيا الخلية حقيقية النواة. النهج المبينة في هذه الورقة أساليب مفيدة لدراسة الآليات الجزيئية المسؤولة عن تشكيل لجنة تنسيق المفردات ،…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
معتمد من قبل مدافع الجسور جبهة الخلاص الوطني للزمالة الدكتوراة. ويدعم المجهر المستخدمة في هذا العمل في جزء من شبكة التصوير منح مجهر البنية التحتية الأساسية من جامعة ولاية كولورادو. ويدعم العمل على محولات clathrin في المختبر من قبل المؤلف ليالي CSU البدء الصناديق وجائزة جمعية القلب الاميركية 09SDG2280525 إلى SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
Riferimenti
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
