In vivo ו במבחנה של אינטראקציה מתאם-clathrin
Summary
Clathrin בתיווך אנדוציטוזה תלוי חלבונים מתאם לתאם מבחר מטען הרכבה מעיל clathrin. כאן אנו מתארים את נוהלי ללמוד מתאם-clathrin אינטראקציה פיזית הדמיה תא חי באמצעות גישות כמודל מתאם endocytic שמרים Sla1p חלבון.
Abstract
מסלול endocytic הגדולות יוזם עם הקמתה של clathrin מצופה שלפוחית (CCVs) כי מטען הובלה מתא השטח כדי endosomes 1-6. CCVs מאופיינים סריג polyhedral של clathrin קרום כי שלפוחית מעילים משמש פיגום מכני. מעילים Clathrin נאספו במהלך היווצרות שלפוחית מ triskelia clathrin הפרט, את הטופס מסיסים של clathrin מורכבת משלושה כבד ושלושה שרשרת אור יחידות משנה 7,8. מכיוון triskelion אין את היכולת לאגד הממברנה ישירות, clathrin מחייב מתאמים הן קריטיות הקישור סריג clathrin להרכיב את הממברנה דרך בשיתוף עם שומנים ו / או חלבונים בממברנה 9. מתאמי גם הטרנסממברני חבילת מטען חלבון, כגון קולטנים, והוא יכול לתקשר אחד עם השני וגם עם רכיבים אחרים של היווצרות CCV מכונות 9.
מעל עשרים מתאמי clathrin תוארו, מספר מעורבים אנדוציטוזה מתווכת clathrin ואחרים למקם את Golgi טרנס רשת או endosomes 9. למעט HIP1R (שמרים Sla2p), כל המתאמים clathrin ידוע להיקשר תחום הטרמינל-N-המדחף של שרשרת כבדה clathrin 9. מתאמי Clathrin הם חלבונים מודולרי המורכב תחומים מקופל המחוברים באמצעות linkers גמישה מובנה. בתוך האזורים הללו והמקשר, מוטיבים מחייב לתווך קצר אינטראקציות עם תחום ה-N-מסוף clathrin או רכיבים אחרים של היווצרות שלפוחית מכונות 9. שני ברורים clathrin מחייב מוטיבים הוגדרו: תיבת clathrin ו-W-9 התיבה. רצף clathrin תיבת קונצנזוס הוגדר במקור L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 אבל וריאנטים התגלו לאחר מכן 11. ה-W-box תואמת PWxxW את הרצף (כאשר x הוא שאריות).
Sla1p (קטלני סינתטי עם אקטין מחייב חלבון-1) זוהה במקור החלבון אקטין הקשורים הכרחי מבנה נורמלי cytoskeleton אקטין ודינמיקה באתרים endocytic בתאי שמרים 12. Sla1p גם קושר את האות NPFxD מיון endocytic הוא קריטי עבור אנדוציטוזה של מטען הנושאת את האות NPFxD 13,14. לאחרונה, Sla1p הודגם להיקשר clathrin באמצעות מוטיב דומה לתיבת clathrin, LLDLQ, כינה גרסה תיבת clathrin-(VCB), וכן לתפקד מתאם clathrin endocytic 15. בנוסף, Sla1p הפך סמן בשימוש נרחב עבור המעיל endocytic ב לחיות פלואורסצנטי תא מחקרים מיקרוסקופיה 16. כאן אנו משתמשים Sla1p כמודל לתיאור גישות מתאם-clathrin מחקרים אינטראקציה. אנו מתמקדים מיקרוסקופ פלואורסצנטי תא חי, GST, לנתץ, ושיתוף immunoprecipitation שיטות.
Protocol
Discussion
Clathrin מצופה שלפוחית (CCV) להשתתף אנדוציטוזה והובלה של Golgi טרנס רשת endosomes, מסלולים שמורים כי הם בסיסי בביולוגיה של התא האיקריוטים. הגישות המתוארת במאמר זה שיטות מועילים כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים האחראים ליצירת CCV, באינטראקציות בין חלבונים מסוימים מתאם cla…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF הוא נתמך על ידי גשרים-NSF המילגה דוקטורט. מיקרוסקופ השתמשו בעבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הדמיה מיקרוסקופ רשת תשתית הליבה מענק מקולורדו סטייט. העבודה על מתאמי clathrin במעבדה המחבר הוא נתמך על ידי המז"פ הזנק וקרנות איגוד הלב האמריקני בפרס 09SDG2280525 אל SD
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
Riferimenti
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
