in vivoおよびアダプター、クラスリンの相互作用のin vitro試験
Summary
クラスリン依存性エンドサイトーシスは、貨物の選択とクラスリン被覆のアセンブリを調整するアダプタータンパク質に依存します。ここではモデルとして酵母エンドサイトーシスのアダプタータンパク質のSla1pを使用してアダプタクラスリンの物理的相互作用および生細胞イメージングのアプローチを研究するための手順を説明します。
Abstract
主要なエンドサイトーシス経路は、細胞表面からの輸送貨物は1-6エンドソームにいるクラスリン被覆小胞（CCVS）の形成を開始します。 CCVSは、そのクラスリンコート小胞の膜の多面体格子によって区別し、機械的な足場として機能している。クラスリンコートは個々のクラスリンtriskelionの複数形、三の重三軽鎖サブユニット7,8から構成されるクラスリンの可溶性形態から小胞形成の間に組み立てられます。三脚ともえ紋が直接細胞膜に結合する能力を持っていないため、クラスリン結合アダプタは、脂質および/ または膜タンパク質9で会合を介して膜に成形クラスリン格子をリンクするために重要です。アダプタには、パッケージの膜貫通タンパク質のような受容体などの貨物、、とお互いに、CCVの形成機構9の他のコンポーネントとやり取りすることができます。
20以上のクラスリンアダプターは、記載されているいくつかは、クラスリン依存性エンドサイトーシスに関与していると他の人は、トランスゴルジネットワークに局在または9をエンドソーム。 HIP1R（酵母Sla2p）を除いて、すべての既知のクラスリンアダプターは、クラスリン重鎖9のN末端-プロペラドメインに結合する。クラスリンアダプターの構造化されていない柔軟なリンカーで接続された折りたたまれたドメインで構成されるモジュラータンパク質である。これらのリンカー領域内で、短い結合モチーフはクラスリンのN -末端ドメインまたは小胞の形成機構9の他のコンポーネントとの相互作用を媒介する。二つの異なるクラスリン結合モチーフが定義されています：クラスリンボックスとW -ボックス9。コンセンサスクラスリンボックスシーケンスはもともとLとして定義されていた[L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10しかし、変種、その後11を発見されている。 W -ボックスは、シーケンスPWxxW（xは任意の残留物である）に準拠しています。
Sla1pは（アクチン結合タンパク質- 1で合成致死）もともとアクチン関連タンパク質として同定し、酵母細胞12のエンドサイトーシスのサイトで通常のアクチン細胞骨格の構造とダイナミクスのために必要ですれました。 Sla1pもNPFxDエンドサイトーシスのソートの信号を結合し、NPFxD信号13,14を担持する貨物のエンドサイトーシスに重要である。最近では、Sla1pはクラスリンボックス、LLDLQに似てモチーフを介してクラスリン結合することが実証された、バリアントクラスリンボックス（VCB）と呼ばれ、エンドサイトーシスのクラスリンアダプター15として機能する。さらに、Sla1pは生細胞の蛍光顕微鏡の研究16におけるエンドサイトーシスのコートに広く使用されているマーカーとなっています。ここでは、アダプタクラスリンの相互作用の研究のためのアプローチを記述するモデルとしてSla1pを使用してください。我々は、生細胞の蛍光顕微鏡に焦点を当てる、ダウンGST -プル、および共免疫沈降法。
Protocol
Discussion
クラスリン被覆小胞（CCV）は、 トランスゴルジネットワークからエンドサイトーシスおよびトランスポートに参加し、真核細胞生物学の基礎となる保存経路をエンドソーム。このメソッドは用紙に記載されてのアプローチは、アダプタータンパク質とクラスリンとの間の特定の相互作用において、CCVの形成に関与する分子メカニズムを研究するために便利です。 GST -融合タンパク質の…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DFは、博士のフェローシップへのNSFのブリッジによってサポートされています。本研究で使用した顕微鏡は、コロラド州立大学から顕微鏡イメージングネットワークコアインフラ助成金によって部分的にサポートされています。著者の研究室でのクラスリンアダプターの作業は、CSUスタートアップ資金と米国心臓協会賞SDへ09SDG2280525でサポートされています
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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