In vivo ve in vitro Adaptör-clathrin Etkileşim Çalışmaları
Summary
Clathrin-aracılı endositoz kargo seçimi ve clathrin kat montaj koordine adaptör proteinler bağlıdır. Burada bir model olarak maya endositik adaptör protein Sla1p kullanarak adaptörü clathrin fiziksel etkileşim ve canlı hücre görüntüleme yaklaşımları incelemek için prosedürler açıklanmaktadır.
Abstract
Büyük bir endositik yolu taşıma kargo hücre yüzeyinden 1-6 endosomes clathrin kaplı vezikül (CCVs) oluşumunu başlatır. CCVs clathrin kat vezikül membran yüzlü bir kafes seçkin ve mekanik bir iskele olarak hizmet vermektedir. Clathrin kat bireysel clathrin triskelia, üç üç ağır ve hafif zincir alt birimden 7,8 oluşan clathrin çözünür formu vezikül oluşumu sırasında monte edilir. Triskelion doğrudan membran bağlama yeteneği olmadığından, clathrin bağlayıcı adaptörler, lipidler ve / veya membran proteinlerinin 9 dernek aracılığıyla membran oluşturan clathrin kafes bağlamak için kritik öneme sahiptir . Adaptörler ayrıca paket transmembran protein bu reseptörler olarak kargo, ve birbirleri ile ve diğer bileşenleri ile CCV, makine 9 etkileşimde bulunabilirsiniz.
Clathrin adaptörler, yirminin üzerinde tanımlanmıştır birçok clathrin aracılı endositoz katılan ve diğerleri trans Golgi ağa lokalize veya 9 endosomes. HIP1R (maya Sla2p) hariç, tüm bilinen clathrin adaptörleri clathrin ağır zincir 9 N-terminal-pervane etki alanına bağlanır. Clathrin adaptörleri yapılandırılmamış esnek linkers bağlı katlanmış etki oluşan modüler proteinlerdir. Bu ilintileyiciniz bölgeler içinde, kısa bağlayıcı motifleri clathrin vezikül oluşumu makine 9 N-terminal etki alanı veya diğer bileşenler ile etkileşimleri arabuluculuk . İki ayrı clathrin bağlayıcı motifleri tarif edilmiştir: clathrin kutusu ve W-box 9. Konsensus clathrin kutu dizisi ilk olarak tanımlandı L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 varyantları daha sonra 11 keşfedilen edilmiştir. W-box dizisi PWxxW (x herhangi bir kalıntı olduğu) için uygundur.
Sla1p (Cehennem Aktin bağlayıcı protein-1 Sentetik), aslında bir aktin ilişkili protein olarak tanımlanan ve maya hücreleri 12 endositik sitelerinde normal aktin hücre iskeletinin yapısı ve dinamikleri için gerekli oldu . Sla1p NPFxD endositik sıralama sinyali bağlanır ve NPFxD sinyal 13,14 taşıyan kargo endositoz için kritik öneme sahiptir. Daha yakın zamanlarda, Sla1p clathrin kutusu, LLDLQ benzer bir motif ile clathrin bağlamak gösterildi, bir varyant clathrin-box (VCB) olarak adlandırılan ve 15 endositik clathrin bir adaptör olarak işlev. Buna ek olarak, Sla1p endositik canlı hücre floresan mikroskop çalışmaları 16 kat için yaygın olarak kullanılan bir belirteç haline gelmiştir. Burada adaptörü clathrin etkileşim çalışmaları için yaklaşımları tanımlamak için bir model olarak Sla1p kullanabilirsiniz. Biz canlı hücre floresan mikroskopi odaklanmak, aşağı GST-pull ve co-immunoprecipitation yöntemleri.
Protocol
Discussion
Clathrin kaplı vezikül (CCV) trans Golgi ağından endositoz ve ulaşım katılmak ve ökaryotik hücre biyolojisi için temel korunmuş yollar endosomes. Bu yöntem kağıt açıklanan yaklaşımlar, adaptör proteinler ve clathrin arasındaki etkileşimler, CCV oluşumu için sorumlu olan moleküler mekanizmalar çalışma yararlıdır. GST-füzyon proteini yakınlık ve ortak immunoprecipitation deneyleri bir adaptör (aday) ve clathrin arasındaki fiziksel ilişki test izin verir. GFP-etiketleme ve flores…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF NSF Köprüler Doktora bursu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmada kullanılan mikroskop Colorado State Üniversitesi Mikroskop Görüntüleme Ağ temel altyapı hibe tarafından kısmen desteklenmektedir. İş yazarı s laboratuvarda clathrin adaptörleri CSU start-up fonları ve SD Amerikan Kalp Derneği ödül 09SDG2280525 tarafından desteklenmektedir
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
Riferimenti
- Mellman, I., Warren, G. The road taken: past and future foundations of membrane traffic. Cell. 100, 99-112 (2000).
- Engqvist-Goldstein, A. E., Drubin, D. G. Actin assembly and endocytosis: from yeast to mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 19, 287-332 (2003).
- Conner, S. D., Schmid, S. L. Regulated portals of entry into the cell. Nature. 422, 37-44 (2003).
- Bonifacino, J. S., Traub, L. M. Signals for sorting of transmembrane proteins to endosomes and lysosomes. Annu Rev Biochem. 72, 395-447 (2003).
- Ungewickell, E. J., Hinrichsen, L. Endocytosis: clathrin-mediated membrane budding. Curr Opin Cell Biol. 19, 417-425 (2007).
- Doherty, G. J., McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annu Rev Biochem. 78, 857-902 (2009).
- Kirchhausen, T. Clathrin. Annu Rev Biochem. 69, 699-727 (2000).
- Brodsky, F. M., Chen, C. Y., Knuehl, C., Towler, M. C., Wakeham, D. E. Biological basket weaving: formation and function of clathrin-coated vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 517-568 (2001).
- Owen, D. J., Collins, B. M., Evans, P. R. Adaptors for clathrin coats: structure and function. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 153-191 (2004).
- Dell’Angelica, E. C., Klumperman, J., Stoorvogel, W., Bonifacino, J. S. Association of the AP-3 adaptor complex with clathrin. Science. 280, 431-434 (1998).
- Dell’Angelica, E. C. Clathrin-binding proteins: got a motif? Join the network!. Trends Cell Biol. 11, 315-318 (2001).
- Holtzman, D. A., Yang, S., Drubin, D. G. Synthetic-lethal interactions identify two novel genes, SLA1 and SLA2, that control membrane cytoskeleton assembly in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. 122, 635-644 (1993).
- Howard, J. P., Hutton, J. L., Olson, J. M., Payne, G. S. Sla1p serves as the targeting signal recognition factor for NPFX(1,2)D-mediated endocytosis. J. Cell. Biol. 157, 315-326 (2002).
- Mahadev, R. K., Pietro, S. M. D. i., Olson, J. M., Piao, H. L., Payne, G. S., Overduin, M. Structure of Sla1p homology domain 1 and interaction with the NPFxD endocytic internalization motif. EMBO J. 26, 1963-1971 (2007).
- Pietro, S. M. D. i., Cascio, D., Feliciano, D., Bowie, J. U., Payne, G. S. Regulation of clathrin adaptor function in endocytosis: A novel role for the SAM domain. EMBO J. 29, 1033-1044 (2010).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123, 305-320 (2005).
- Longtine, M. S., McKenzie, A., Demarini, D. J., Shah, N. G., Wach, A., Brachat, A., Philippsen, P., Pringle, J. R. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14, 953-9561 (1998).
- Wach, A., Brachat, A., Alberti-Segui, C., Rebischung, C., Philippsen, P. Heterologous HIS3 marker and GFP reporter modules for PCR-targeting in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 13, 1065-1075 (1997).
- Robinson, J. S., Klionsky, D. J., Banta, L. M., Emr, S. D. Protein sorting in Saccharomyces cerevisiae: isolation of mutants defective in the delivery and processing of multiple vacuolar hydrolases. Mol Cell Biol. 8, 4936-4948 (1988).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J. Bacteriology. 153, 163-168 (1983).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetica. 122, 19-27 (1989).
- Piao, H. L., Machado, I. M., Payne, G. S. NPFXD-mediated endocytosis is required for polarity and function of a yeast cell wall stress sensor. Mol Biol Cell. 18, 57-65 (2007).
