免疫印迹检测样品制备
Summary
Western印迹分析技术，用于检测特定的蛋白质，在一个给定的样本，组织匀浆或提取。
Abstract
Western印迹分析技术，用于检测特定的蛋白质，在一个给定的样本，组织匀浆或提取。它采用凝胶电泳分离长度的多肽（变性条件下），或由本地或变性蛋白的蛋白质三维结构（本机/非变性条件）。然后转移到一个膜（通常是硝酸纤维素或PVDF），他们在那里探测（检测）使用特定的靶蛋白的抗体的蛋白质。
Protocol
1。样品制备在免疫印迹的第一步是样品制备。为了准备运行的一种凝胶体细胞和组织样本需要，裂解释放的利益蛋白质。 一个方便，随时可以使用的试剂，这是通用和易于使用的可溶性蛋白提取CytoBuster或PhosphoSafe。这些提取缓冲区包含从哺乳动物和昆虫细胞中高效提取可溶性蛋白优化的洗涤剂。温柔，非离子组成CytoBuster蛋白抽提试剂，使隔离功能活跃的内源性或表达的蛋白质，而不需要为二级处理，如超声或冻结/解冻。 PhoshoSafe包含四个磷酸酶抑制剂的额外的好处。 颗粒细胞低速离心（如5分钟在2500 XG），漏细胞沉淀。 重悬在CytoBuster蛋白抽提试剂使用150μL（CytoBuster蛋白抽提试剂细胞大小的最佳数量可能会有所不同），每10 6细胞的细胞。 在室温下孵育5分钟。 转移到一个合适的管和自旋为16000 XG 5分钟，在4 ° C。 转让清除上清液（细胞提取物）到一个新的管，并进行分析。 专门蛋白提取，我们建议使用我们的高品质的ProteoExtract工具箱。 EMD有十几家线粒体隔离，亚细胞蛋白质组的提取，跨膜蛋白的提取，以及许多其他的套件。进一步详情，请访问我们的免疫印迹登陆页面。 EMD还销售多种蛋白酶和磷酸酶抑制剂的鸡尾酒集。只要发生裂解，水解，去磷酸化和变性的开始。这些事件可以大大减慢，如果样品是在冰上或保持在4 ° C是在任何时候和适当的抑制剂增添了新鲜的裂解液。进一步详情，请访问我们的免疫印迹登陆页面。 2。 SDS – PAGE电泳在西方印迹的第二步是蛋白质的分离。根据分子量蛋白质分离。 您可以使自己的网页凝胶，但是我们将使用一个商业预制凝胶。 准备您的样品后，您已经准备好，以确定蛋白质浓度。 EMD还有两个包来衡量浓度，一个是无干扰的蛋白质检测试剂盒和其他BCA蛋白检测试剂盒。 蛋白浓度是评估后，我们随时准备为我们的样本中加载凝胶。抗体通常认识到一个感兴趣的蛋白质的一小部分（简称表面抗原），此域名可能驻留在蛋白质的三维构象。为了使这部分有必要开展的蛋白质抗体的访问。 变性，变性的阴离子洗涤剂十二烷基硫酸钠（SDS）使用一个样缓冲液，煮沸5分钟的混合物在95-100 ° C。使用一种简单，方便装载缓冲4X采样缓冲器。 道上混的蛋白Marker负载以及第一线。这标志有三个参考乐队，让你可以监控电泳。当凝胶染色，10波段可见范围从10-225 kDa的。 填充运行缓冲液的电泳单位。对于PAGE凝胶，这是通常1X Tris -甘氨酸。如需详细缓冲食谱，请访问Western印迹页。电解二氧化锰与我们的OmniPur化工行提供高品质的缓冲液试剂。 1小时，运行在220V的凝胶。 一旦分离出来的蛋白质，考马斯蓝染色的凝胶，以确保均匀，均匀的蛋白质已迁移。 RAPIDstain是超敏感的污点，这是准备使用的。没有脱色是必需的。 3。蛋白转移正如电荷的蛋白质可诱发穿行在一个电场凝胶，因此可以将蛋白质转移到一个电场，从凝胶上膜，PVDF或硝酸纤维素。 今天，我们将尽湿的转移。在调湿，凝胶和膜夹在海绵和纸（海绵/纸/凝胶/膜/纸/海绵），都紧紧夹住后，确保无气泡，凝胶和膜之间形成。三明治是淹没在电场应用到传输缓冲区。旅游对带正电荷的电极的，负电荷的蛋白质，但膜停止它们，它们绑定，并阻止他们继续进行。 两种类型的膜：硝酸纤维素和聚偏氟乙烯。以及它们的工作原理。今天我们将使用聚偏氟乙烯。 PVDF膜需要浸泡在methano升了几分钟，冰冷转印缓冲液5分钟。凝胶也需要平衡在冰冷的传输缓冲区几分钟。如果不这样做，可能会在传输过程中的收缩凝胶。 调湿的缓冲区是用20％甲醇1X Tris -甘氨酸。我们的网站上提供详细的缓冲准备工作。 一旦传输完成，这是一个好主意，可视化的蛋白质，以确保没有气泡，甚至转移。这可以很容易地与RedAlert免疫印迹染色。这个污点是准备使用的，可以很容易与水脱色。 4。抗体及辅助试剂在做探测和抗体的抗原的第一步，是块膜。阻断膜，防止非特异性背景约束力。 要么不低脂牛奶或BSA可以被用来作为一个阻塞的解决方案。然而，当使用磷酸化特异性抗体，这是不建议使用牛奶，因为它会导致高背景。 电解二氧化锰提供几个高品质的阻塞包括SeaBlock试剂，这是一个非哺乳动物的阻断剂的印迹QuickBlocker，这是准备，随时可以使用的阻断剂。我们也有高品质的BSA（组分V）提供。 在室温下轻轻摇动下孵育膜1小时。 孵化后在TBST或PBST清洗三次。一个简单方便的方式，使TBST或PBST使用我们的片（PBS吐温片/ TBS电视台吐温片） 一旦膜已被封锁，你准备的主要抗体孵育。电解二氧化锰已在行业中最好的抗体超过30年的保证提供全面的产品组合的特殊抗体。请记住，所有EMD的抗体，我们提供了一个完整的100％保证无风险。购买一种抗体，它使用任何物种特异性或应用程序，你的愿望。如果抗体不工作，您的满意，我们将提供一个完整的信用卡被用于任何其他产品。有关详细信息，请访问我们的免疫印迹网页。 今天，我们将培育我们的主要抗体，使用的SignalBoost解决方案1。 SignalBoost是一个伟大的产品，让你的信号大大加强。简单的解决方案1孵化您的主要抗体，孵育1小时，或像往常一样。有没有需要进一步补充阻断剂。或者，您可以使用BSA或脱脂奶粉作为阻断剂。 洗涤用TBST。我们TBST使用现成的TBST溶解平板。 孵育二级抗体使用的SignalBoost解决方案2。孵育二级抗体阻断1小时的缓冲。再次洗膜用TBST几次。 5。检测辣根过氧化物酶偶联的二抗，ECL是传统上用来。我们提供一个很好的ECL试剂RapidStep。 RapidStep的优点是没有管腔或增强的混合要求。只需喷膜几次和开发利用X射线胶片。 RapidStep提供的基板此外后象形图的灵敏度低，以及长达2个小时的发光。
Discussion
在这个视频演示，我们已经强调了免疫印迹的样品制备的主要步骤，SDS – PAGE电泳，膜抗体阻断/探测，和检测。对于过程的每一个一步，适当的协议和相应的试剂应使用，以达到高品质的结果。
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).