पश्चिमी सोख्ता: जांच के लिए नमूना तैयार
Summary
सोख्ता पश्चिमी ऊतक homogenate या निकालने के किसी नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक का इस्तेमाल है.
Abstract
सोख्ता पश्चिमी ऊतक homogenate या निकालने के किसी नमूने में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक विश्लेषणात्मक तकनीक का इस्तेमाल है. यह जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करता है पॉलीपेप्टाइड की लंबाई (denaturing शर्तों) या प्रोटीन की संरचना 3-D (देशी / गैर denaturing शर्तों) द्वारा देशी या विकृत प्रोटीन को अलग है. प्रोटीन तो (आमतौर पर nitrocellulose या PVDF झिल्ली), (पता चला), जहां वे जांच कर रहे हैं लक्ष्य प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं.
Protocol
1. नमूना तैयार पश्चिमी सोख्ता में पहला कदम नमूना तैयारी है. एक जेल कोशिकाओं और ऊतकों को चलाने के लिए नमूने तैयार करने के लिए करने के लिए ब्याज की प्रोटीन रिहाई lysed की जरूरत है. एक सुविधाजनक, अभिकर्मक उपयोग करने के लिए तैयार है कि बहुमुखी और घुलनशील प्रोटीन निष्कर्षण के लिए उपयोग करने के लिए आसान है CytoBuster या PhosphoSafe है. ये निष्कर्षण बफ़र्स स्तनधारी और कीट कोशिकाओं से घुलनशील प्रोटीन के कुशल निकासी के लिए अनुकूलित डिटर्जेंट होते हैं. कोमल, CytoBuster प्रोटीन निकालना अभिकर्मक की संरचना गैर ईओण जैसे sonication या फ्रीज पिघलना / माध्यमिक उपचार के लिए एक की जरूरत के बिना कार्यात्मक सक्रिय अंतर्जात या व्यक्त प्रोटीन के अलगाव के लिए सक्षम बनाता है. PhoshoSafe जिसमें चार फॉस्फेट inhibitors का जोड़ा लाभ है. गोली कम गति centrifugation (जैसे 2500 XG पर 5 मिनट) द्वारा कोशिकाओं, सेल गोली अच्छी तरह से नाली. CytoBuster प्रोटीन निकालना अभिकर्मक 10 6 कोशिकाओं 150 प्रति μL (CytoBuster प्रोटीन निकालना अभिकर्मक के इष्टतम राशि सेल के आकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं) का उपयोग में कोशिकाओं Resuspend . 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. एक उपयुक्त ट्यूब पर स्थानांतरण और 16,000 XG पर 5 मिनट के लिए 4 में स्पिन डिग्री सेल्सियस स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला को मंजूरी दे दी (सेल निकालने) एक ताजा ट्यूब और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना. विशेष प्रोटीन निष्कर्षण के लिए, हम हमारे उच्च गुणवत्ता ProteoExtract किट का उपयोग की सलाह देते हैं. ईएमडी mitochondrial अलगाव, subcellular proteome निष्कर्षण, transmembrane प्रोटीन निष्कर्षण, और कई दूसरों के लिए एक दर्जन से अधिक किट है. कृपया अधिक जानकारी के लिए हमारी पश्चिमी धब्बा लैंडिंग पृष्ठ पर जाएँ. ईएमडी भी protease और फॉस्फेट अवरोध करनेवाला कॉकटेल सेट की एक विस्तृत विविधता बेचता है. जैसे ही lysis होता है, proteolysis dephosphorylation, और विकृतीकरण शुरू करते हैं. इन घटनाओं के नीचे काफी धीमा हो सकता है अगर नमूने बर्फ पर या 4 में रखा जाता है ° सी सभी बार और उचित inhibitors के lysis बफर करने के लिए ताजा जोड़ रहे हैं. कृपया अधिक जानकारी के लिए हमारी पश्चिमी धब्बा लैंडिंग पृष्ठ पर जाएँ. 2. एसडीएस पृष्ठ पश्चिमी में दूसरा कदम सोख्ता प्रोटीन जुदाई है. प्रोटीन आणविक भार के आधार पर अलग हो रहे हैं. आप अपने पृष्ठ जेल कर सकते हैं, लेकिन हम एक व्यावसायिक पूर्व डाली जेल का उपयोग किया जाएगा. अपने नमूना तैयार करने के बाद, आप प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए तैयार हैं. ईएमडी इस के लिए दो किट एकाग्रता को मापने है, एक गैर दखल प्रोटीन परख किट और बीसीए प्रोटीन परख किट जा रहा है अन्य किया जा रहा है. एक बार प्रोटीन एकाग्रता का आकलन है कि हम जेल लोड करने के लिए हमारी नमूना तैयार करने के लिए तैयार हैं. एंटीबॉडी आमतौर पर ब्याज की प्रोटीन का एक छोटा सा हिस्सा (मिलान के रूप में में संदर्भित) को समझते हैं और इस डोमेन प्रोटीन के 3D रचना के भीतर रहते हैं हो सकता है. एंटीबॉडी के इस भाग है यह आवश्यक है प्रोटीन उधेड़ना करने के लिए पहुँच सक्षम करने के लिए. Denature, anionic denaturing डिटर्जेंट का सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) के साथ एक लोड हो रहा है बफर का उपयोग, और 95-100 ° सी में 5 मिनट के लिए मिश्रण फोड़ा. एक आसान और सुविधाजनक लोड हो रहा है बफर का उपयोग करने के लिए 4X नमूना बफर है. ट्रेल मिक्स प्रोटीन मार्कर के साथ अच्छी तरह से पहले लेन लोड. इस मार्कर तीन संदर्भ बैंड है जो आप वैद्युतकणसंचलन निगरानी करने की अनुमति है. जब जेल दाग है, 10 बैंड 10-225 केडीए से लेकर दिखाई दे रहे हैं. बफर चल रहा है के साथ वैद्युतकणसंचलन इकाई भरें. पृष्ठ जैल के लिए, यह आमतौर पर Tris ग्लाइसिन 1X है. विस्तृत बफर व्यंजनों के लिए पश्चिमी सोख्ता पृष्ठ पर जाएँ. ईएमडी हमारे OmniPur रासायनिक लाइन के साथ उच्च गुणवत्ता वाले बफ़र्स अभिकर्मकों प्रदान करता है. 220V पर 1 घंटे के लिए जेल चलाएँ. एक बार प्रोटीन को अलग है, Coomassie नीले रंग के साथ जेल दाग प्रोटीन को समान रूप से और समान चले गए करने के लिए सुनिश्चित करें. RAPIDstain एक अति संवेदनशील दाग जो उपयोग करने के लिए तैयार है. नहीं destaining आवश्यक है. 3. प्रोटीन स्थानांतरण बस के रूप में एक बिजली के प्रभारी के साथ प्रोटीन के लिए एक बिजली के क्षेत्र में एक जेल के माध्यम से यात्रा करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, तो प्रोटीन जेल से कर सकते हैं एक बिजली के क्षेत्र में हस्तांतरित एक झिल्ली पर, या तो PVDF या nitrocellulose जा रहा है. आज हम एक गीला हस्तांतरण करना होगा. गीला हस्तांतरण में, जेल और झिल्ली स्पंज और कागज (स्पंज / कागज / / जेल / / समाचार पत्र स्पंज झिल्ली) और सभी कसकर clamped रहे हैं यह सुनिश्चित करने के बाद जेल और झिल्ली के बीच कोई हवाई बुलबुले का गठन किया है एक साथ के बीच sandwiched हैं. सैंडविच हस्तांतरण बफर करने के लिए जो एक बिजली के क्षेत्र लागू किया जाता है में डूबे हुए है. नकारात्मक आरोप लगाया प्रोटीन सकारात्मक आरोप लगाया इलेक्ट्रोड की ओर से यात्रा, लेकिन झिल्ली उन्हें बंद हो जाता है है उन्हें बांधता है, और उन्हें जारी रखने से रोकता है. झिल्ली के दो प्रकार उपलब्ध हैं: nitrocellulose और PVDF. दोनों अच्छी तरह से काम. आज हम PVDF का उपयोग किया जाएगा. PVDF झिल्ली methano में भिगोने की आवश्यकता होती हैकुछ मिनट के लिए, मैं 5 मिनट के लिए बर्फ ठंड हस्तांतरण बफर द्वारा पीछा किया. जेल में भी बर्फ के ठंडे हस्तांतरण बफर में कुछ मिनट के लिए संतुलित करने की जरूरत है. नहीं तो कर स्थानांतरण के दौरान जेल हटना सकता है. गीला हस्तांतरण के लिए 20% मेथनॉल के साथ बफर Tris – ग्लाइसिन 1X है. विस्तृत बफर तैयारी हमारी वेबसाइट पर उपलब्ध हैं. एक बार स्थानांतरण पूरा हो गया है, यह एक अच्छा विचार प्रोटीन कल्पना भी सुनिश्चित करें कोई हवा जेब के साथ हस्तांतरण है. यह आसानी से RedAlert वेस्टर्न ब्लाट दाग के साथ किया जा सकता है. यह दाग़ उपयोग करने के लिए तैयार है और destaining पानी के साथ आसानी से किया जा सकता है. 4. एंटीबॉडी और गौण अभिकर्मकों प्रतिजन के लिए जांच और एंटीबॉडी कर में पहला कदम झिल्ली ब्लॉक है. झिल्ली अवरुद्ध गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि बाध्यकारी रोकता है. या तो गैर वसा दूध या BSA एक अवरुद्ध समाधान के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, जब phospho विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग कर, यह रूप में इसे उच्च पृष्ठभूमि के कारण होगा करने के लिए दूध का उपयोग नहीं की सिफारिश की है. ईएमडी SeaBlock सहित कई उच्च गुणवत्ता अवरुद्ध अभिकर्मकों,, जो एक गैर स्तनधारी अवरुद्ध एजेंट और ब्लाट QuickBlocker है, जो तैयार है तैयार उपयोग एजेंट अवरुद्ध. प्रदान करता है हम भी उच्च गुणवत्ता BSA (भिन्न वी) उपलब्ध है. कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर झिल्ली 1 घंटे सेते हैं. TBST या ऊष्मायन के बाद PBST में तीन बार धोएं. एक आसान और सुविधाजनक TBST या PBST बनाने के लिए रास्ता हमारे गोलियों का उपयोग करें (पीबीएस के बीच गोलियाँ / टीबीएस के बीच गोलियाँ) एक बार झिल्ली को अवरोधित किया गया है, तो आप प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते के लिए तैयार हैं. ईएमडी उद्योग में 30 से अधिक वर्षों के लिए सबसे अच्छा एंटीबॉडी गारंटी के साथ किया गया है असाधारण एंटीबॉडी के एक व्यापक पोर्टफोलियो की पेशकश की. याद रखें कि सभी ईएमडी एंटीबॉडी के साथ, हम एक पूर्ण 100% गारंटी कोई जोखिम प्रदान करते हैं. एक एंटीबॉडी खरीद और यह किसी भी प्रजाति विशिष्टता या आवेदन तुम इच्छा के लिए उपयोग. यदि प्रतिरक्षी अपनी संतुष्टि के लिए काम नहीं करता है, हम एक पूरा करने के लिए किसी भी अन्य उत्पाद पर इस्तेमाल किया जा क्रेडिट प्रदान करेगा. अधिक जानकारी के लिए, कृपया हमारे पश्चिमी सोख्ता वेब पेज पर जाएँ. आज हम अपने प्राथमिक SignalBoost के एक समाधान का उपयोग एंटीबॉडी incubating जाएगा. SignalBoost एक महान अनुमति अपने संकेत काफी बढ़ाया उत्पाद है. बस 1 समाधान में अपनी प्राथमिक एंटीबॉडी सेते और 1 घंटे के लिए या के रूप में आप सामान्य रूप से होता सेते हैं. वहाँ कोई आगे अवरुद्ध एजेंट को जोड़ने की जरूरत है. वैकल्पिक रूप से, आप BSA या नोनफेट शुष्क दूध एक अवरुद्ध एजेंट के रूप में उपयोग कर सकते हैं. TBST के साथ धोएं. हम के लिए तैयार भंग का उपयोग TBST गोली TBST करते हैं. अपने माध्यमिक SignalBoost के 2 समाधान का उपयोग एंटीबॉडी सेते हैं. 1 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी सेते हैं. झिल्ली फिर TBST के साथ कई बार धो. 5. खोज एचआरपी conjugating माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, ईसीएल परंपरागत उपयोग किया जाता है. एक उत्कृष्ट ईसीएल अभिकर्मक की पेशकश हम RapidStep है. RapidStep के लाभ कर रहे हैं कि luminal या बढ़ाने का कोई मिश्रण की आवश्यकता है. बस झिल्ली स्प्रे एक बार कुछ और एक्स – रे फिल्म का उपयोग कर विकसित. RapidStep सब्सट्रेट के अलावा के बाद कम pictogram के रूप में अच्छी तरह के रूप में 2 घंटे के लिए प्रकाश उत्सर्जक संवेदनशीलता प्रदान करता है.
Discussion
इस वीडियो प्रस्तुति में, हम पश्चिमी सोख्ता में प्रमुख कदम है जो नमूना तैयारी कर रहे हैं पर प्रकाश डाला है, एसडीएस पृष्ठ अवरुद्ध / एंटीबॉडी के साथ जांच झिल्ली, और पहचान. प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए उचित प्रोटोकॉल और उचित अभिकर्मकों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले परिणामों को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Eslami, A., Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. J. Vis. Exp. (44), e2359, doi:10.3791/2359 (2010).