Protocollo per la produzione di un incrocio fra i roditori parassiti della malaria

Summary

Incroci genetici di parassiti della malaria roditori vengono eseguite da mangiare due parassiti geneticamente distinte alle zanzare. Ricombinante progenie vengono clonati dal sangue del mouse dopo aver lasciato le zanzare a mordere topi infettati. Questo video mostra come produrre incroci genetici di<em> Plasmodium yoelii</em> Ed è applicabile ad altri parassiti della malaria roditori.

Abstract

Variazione di risposta ai farmaci antimalarici e della patogenicità dei parassiti della malaria è di importanza biologica e medica. Mappatura collegamento ha portato alla identificazione di successo di geni o loci sottostante vari tratti di parassiti della malaria di roditori ^1-3 e gli esseri umani ^4-6. Il parassita della malaria Plasmodium yoelii è una delle specie di malaria molti isolato da roditori selvatici africani ed è stato adattato a crescere in laboratorio. Questa specie riproduce molte delle caratteristiche biologiche dei parassiti della malaria umana; marcatori genetici come microsatelliti e amplificato frammento lunghezza polimorfismo (AFLP) i marcatori sono stati sviluppati anche per il parassita ^7-9. Così, gli studi genetici in parassiti della malaria roditori possono essere eseguite per completare le ricerche sul Plasmodium falciparum. Qui, noi dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio in P. yoelii che sono stati pionieri di Drs. David Walliker, Richard Carter, ei suoi colleghi presso l'Università di Edimburgo ^10.

Incroci genetici in P. yoelii e altri parassiti della malaria roditori sono condotte da infettando i topi Mus musculus con un inoculo contenente gametociti di due cloni geneticamente distinte che si differenziano per fenotipi di interesse e permettendo zanzare di nutrirsi di topi infettati 4 giorni dopo l'infezione. La presenza di gametociti maschili e femminili nel sangue mouse è microscopicamente confermato prima della somministrazione. Entro 48 ore dopo il pasto, nel midgut della zanzara, i gametociti aploide differenziarsi in gameti maschili e femminili, fertilizzare, e forma uno zigote diploide (Fig. 1). Durante lo sviluppo di uno zigote in un ookinete, meiosi sembra verificarsi ^11. Se lo zigote è il risultato di fertilizzazione incrociata tra gameti di due parassiti geneticamente distinte, scambi genetici (riassortimento cromosomiche e cross-over tra i non-sorella cromatidi di una coppia di cromosomi omologhi;. Fig. 2) possono verificarsi, con conseguente ricombinazione di materiale genetico di loci omologhi. Ogni zigote subisce due successive divisioni nucleari, portando a quattro nuclei aploidi. Un ookinete sviluppa in un oocisti. Una volta che il oocisti matura, migliaia di sporozoiti (la progenie della croce) sono prodotti ed emessi in hemoceal zanzara. Sporozoiti vengono raccolte dalle ghiandole salivari e iniettato in un nuovo ospite murino, dove lo sviluppo fase pre-eritrocitaria e eritrocitaria avviene. Forme eritrocitaria sono clonati e classificati in relazione ai caratteri distintivi delle linee parentali prima mappatura linkage genetico. Infezioni controllo dei singoli cloni dei genitori vengono eseguite nello stesso modo come la produzione di un incrocio.

Protocol

Tecniche asettiche devono essere applicati a tutti i materiali che saranno somministrati in animali al fine di evitare l'introduzione accidentale di agenti infettivi esogeni in topi che possono confondere i risultati sperimentali. 1. L'infezione di topi da laboratorio con sangue stadio parassiti della malaria A temperatura ambiente, disgelo due fiale contenenti il ​​sangue congelato parassiti della malaria stadio da attraversare. In questo esempio, due ceppi di roditor…

Discussion

Dimostriamo le tecniche per la produzione di un incrocio nella malaria da Plasmodium yoelii roditore, che è applicabile anche alla produzione di croci genetica in malarie altri roditori. Infezioni di topi con singoli cloni dei genitori sono di solito eseguite per determinare la trasmissione di successo dei parassiti dei genitori per garantire che i genitori sono competenti nel produrre gameti funzionali prima di eseguire una croce.

Trasmissione di successo attraverso una zanzara è…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Glyerolyte 57 solution		Cenmed	4A7833
Mouse Mus musculus		Charles River Laboratory		Female, inbred, strain Balb/C
Heat-inactivated calf serum		Invitrogen	26010-066
Phosphate buffered saline (PBS) solution		Invitrogen	10010-072	pH 7.4; Cell Culture grade
Malaria parasite Plasmodium yoelii yoelii 17XNL(1.1)		MR4	MRA-593	deposited by DJ Carucci
Malaria parasite Plasmodium yoelii nigeriensis N67		MR4	MRA-427	deposited by W Peters, BL Robinson, R Killick Kendrick
Mosquito Anopheles stephensi		MR4	MRA-128	deposited by MQ Benedict
Cellometer automatic cell counter		Nexcelom Biosciences	Cellometer Auto T4
Cellometer CP2 disposable hemacytometer		Nexcelom Biosciences	Cellometer CP2
High Pure PCR template preparation kit		Roche Applied Science	11 796 828 001
Calcium chloride		Sigma-Aldrich	C5670	Cell culture tested; insect cell culture tested
Giemsa stain, modified		Sigma-Aldrich	GS500
Ketamine hydrochloride		Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-2013-01	Pharmaceutical grade; concentration to 100 mg/mL
Potassium chloride		Sigma-Aldrich	P5405	Cell culture tested; insect cell culture tested
Sodium chloride		Sigma-Aldrich	S5886	Cell culture tested; insect cell culture tested
Trisodium citrate dihydrate		Sigma-Aldrich	S4641
Xylazine		Akorn Inc.	4811-20ml	Pharmaceutical grade; concentration to 20 mg/mL
Glass wool		VWR	32848-003
Glass capillary (1 μL)		VWR	53440-001
Hemocytometer		VWR	15170-168	Complete chamber set
Homogenizer		VWR	KT749520-0090	Pestle with matching tube, 1.5 mL

SUPPLEMENTARY MATERIALS:

• Maintenance of laboratory mice
• Maintenance of laboratory mosquitoes
• Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain
• Measurement of red blood cell density

Maintenance of laboratory mice

Females of inbred laboratory mouse strain BALB/c, aged 5 to 8 weeks old, are used in the study. Mice are housed in a standard solid-bottom polycarbonate cage with wire-bar lid, equipped with feeder and a water bottle. Mice are maintained at a constant temperature (25 ± 1°C) on 12:12 hour light:dark cycle. Mice are allowed to feed on 2018S Harlan Teklad Global 19% protein extruded rodent diet (sterilizable; from Harlan-Teklad) and supplied with acidified drinking water ad libitum. Experiments on animals are performed in accordance with the guidelines and regulations set forth by the Animal Care and Use Committee at the National Institute of Allergy and Infectious Disease under protocol LMVR11E (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland).

Maintenance of laboratory mosquitoes

Mosquitoes are from a laboratory-bred colony of Anopheles stephensi. The adults are maintained in nylon cages kept in a temperature- and humidity-controlled room (23 to 25°C for Plasmodium yoelii and Plasmodium chabaudi, and 19 to 21°C for Plasmodium berghei; 80 to 95% humidity; on 12:12 hours light:dark cycle). Adult mosquitoes are fed with 10% glucose and 2.00% para-aminobenzoic acid (PABA) supplemented water solution. To obtain high-quality adults, 500 larvae are grown in a low-density condition in 1 L of distilled water in a 1,000-cm³ open dish supplied with approximately 1 mg of sodium bicarbonate. After hatching, the larvae are given tetramin powder (PETCO) until they develop into the pupa stage and are transferred to the adult mosquito cages for emerging.

Microscopic examination of thin blood smears stained with Giemsa stain

Using clean scissors snip off the tip (1.0 mm) of the infected mouse’s tail. Place one drop (0.5-1.0 μL) of tail blood onto a clean specimen slide. Mouse will stop bleeding in 1-2 min. Place a clean spreader slide on top of the blood drop, maintaining it at a 45° angle relative to the specimen slide, and allow the blood to adsorb to the entire width of the spreader. Hold the specimen slide and push forward the spreader slide rapidly and smoothly to produce a thin smear. Let the blood film dry, and then immerse the slides in absolute methanol. Allow the slide to air dry once more before covering it with Giemsa stain (10% Giemsa dye in distilled water). After incubating the thin blood films for 10-15 min at room temperature, carefully rinse the slides with tap water and let it air dry. Examine the number of infected red blood cells (iRBC; see Figure 3 for morphology of infected RBC) under a light microscope with immersion oil at 1000x magnification (with 100x objective lens) and calculate parasitemia (the number of iRBC per 100 RBC counted). Different strains of malaria parasites vary in growth rate and pathogenicity. Monitoring of blood stage parasitaemias can be performed 24hrs after injections, depending on the dose of the blood stage malaria parasites. For example, mice will be microscopically positive 24 hrs when injected with 10⁷ infected RBC intraperitoneally or 10⁶ infected RBC intravenously.

Measurement of red blood cell density

Like the levels of parasitaemias, red blood cell (RBC) density in infected mice varies throughout the course of infection. RBC density should be measured within 1-2 hrs before the start of the single- and mixed-clone infection and the cloning experiments. There are two methods for measurement of RBC density: a manual counting using Neubauer hemocytometer and an automatic counting using a Cellometer (Nexcelom Bioscience). In both methods, withdraw 1 μL of mouse tail blood using a glass capillary (VWR) and dilute in 10 mL of PBS and mix well. To use a Neubauer hemocytometer, load 20 μL of the suspension onto the hemacytometer. Place the hemacytometer on a light microscope with 10x objective lens. The hemacytometer contains a grid divided into 9 large squares, and 4 large squares at the corner are further divided into 16 small squares. Count the total number of cells in each of the 16 small squares in the four corner squares. To avoid counting bias or counting cells that overlap a grid line, count a cell as “in” if it overlaps the top or right lines and “out” if it overlaps the bottom or left lines. Estimate the number of cells per one small square and divide by 0.00625 (the volume of one small square is 6.25 nL). This yields the number of cells per microliter (μL). From this data, calculate the final red blood cell density by multiplying with 10,000 (a dilution factor). Rinse the cover slip and counting chamber with distilled water and 70% ethanol; air dry. Alternatively, load 20 μL of the suspension onto a Cellometer counting chamber slide. Insert the slide into a Cellometer slide chamber (the reader). Start the Cellometer software, select the “red blood cell” option, and enter a dilution factor of 10,000. Record the RBC density.