B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염
Summary
에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인 시스템<em> 예 생체내</em지라 B – lymphocytes의> 문화 설명되어 있습니다. 이 메서드는 도우미 무료 ecotrophic 포장 세포주에서 재조합 retroviral 생산을 활용합니다. 안정적인 수준의 스위치 재조합을받은 B 세포 표면 항체의 생성으로 이어지는 이루어집니다 주 lymphocytes 이내에 관심이 유전자의 표현을 물려 전할 수있는.
Abstract
진핵 세포에있는 유전자의 형질 표현 관심의 유전자가 결과의 표현형 분석을 용이하게하기 위해 heterologous 표현 시스템의 제어하에 표현되는 강력한 반대 유전자 접근 방식이다. 이 접근 방법은 일반적으로 유기체에서 발견되지 않은 유전자를 표현하는 유전자 제품의 돌연변이 형태를 표현하기 위해, 또는 유전자 제품의 지배 – 부정적인 양식을 통해 – 표현하는 데 사용될 수 있습니다. 그것은 transcriptional 규정이 2-4 검토 B 세포 1의 개발과 차별화의 주요 제어 메커니즘입니다 hematopoetic 시스템의 연구에서 특히 유용합니다.
마우스 유전학은 인간의 유전자와 질병의 연구를위한 강력한 도구입니다. 마우스와 인간 게놈의 비교 분석은 게놈 5 90 % 이상의 synteny의 절약을 보여준다. 또한, 많은 마우스 모델에 사용되는 기술의 예를 들어, 유전자 중단 및 allelic 교체 6 인간의 유전자 연구에 적용 . 그러나, 유전자 변형 마우스의 생성은 재정 및 기술 자연 모두 자원의 큰 거래를 필요로합니다. 몇몇 프로젝트는 마우스 변종을 노크의 라이브러리 (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) 또는 대규모 노력과 협업 7 필요한 돌연변이 유발 유도 변종 (RIKEN)를 컴파일하기 시작했다. 따라서, 먼저 마우스 모델에 진행하기 전에 기본 세포의 세포 배양 모델에 원하는 유전자의 표현형 연구를하는 것이 바람직하다.
Retroviral DNA는 안정의 결과, 선호 내에서 또는 전사 단위 또는 CPG 섬으로 근처 호스트 DNA에 통합하여 transcriptional 입을 8 9을 회피하면서 관심의 포장 유전자의 표현을 물려 전할 수있는. 유전자는 다음 전사 및 단백질 생산의 높은 효율성의 결과, 높은 효율 retroviral 발기인의 통제하에 베꼈는데 있습니다. 따라서, retroviral 표현은 transfect하기 어려운 세포와 함께 사용 유사 분열 동안 활성 상태에있는 세포를 제공할 수 있습니다. 바이러스의 구조 유전자가 패키징 세포주에 포함된 있기 때문에, 관심있는 유전자를 복제하는 데 사용되는 표현 벡터는 모두 바이러스 revertants의 가능성을 제거하고 바이러스 supernatants 작업의 안전을 증가하는, 바이러스에 대한 구조 유전자를 포함하지 더 전염성 virions는 10을 생산하지 않습니다로.
여기 재조합 retroviral 생산과 지라 B 세포의 후속 감염에 대한 프로토콜을 제시한다. 분리 후, 교양 지라 세포 목 파생 lymphokines 및 B 세포의 증식과 분화 11 파열을 유도 방지 CD40과 자극하고 있습니다. 이 프로토콜은 B 세포가 plasmacytic 분화를 유도하는 것을 원칙으로하지만 이전 antigenic의 자극에 초기 hematopoetic 이벤트 다음과 비장으로부터 격리되면서, 늦은 B 세포 개발과 차별에서 발생 사건의 연구에 이상적입니다.
Protocol
Discussion
lymphopoesis의 발달 이벤트의 많은가 transcriptional 규칙 1, 2에 의해 제어되기 때문에 그림 1에 여기에서 설명한과 같이 묘사 같은 지라 B 세포의 Retroviral 도입은 B – lymphocytes의 연구에 유용 유전자 접근 방식이다. CD40L를 통해 트리거링 B 세포 성숙의 나중 단계에서 B 세포 성장의 유도, 세포주기에 진입하고, 증식 11, 20 필수입니다. 그림 2에 표시된, B 세포는 확?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CK는 컬럼비아 대학 대학원 프로그램에 의해 지원됩니다. UB는 미국의 백혈병과 림프종 사회, 백혈병 연구 재단의 새로운 탐정 수상의 수신자의 연구원이며, 컬럼비아 대학 뉴 학부 시동 자금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | ||
| RPMI | Invitrogen/Gibco | 22400 | ||
| PBS | Invitrogen/Gibco | 20012 | ||
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma Aldrich | R7757 | ||
| CD43 beads | Miltenyi | |||
| B Cell Complete Media | Various components | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercaptoethanol | |
| IL-4 | ||||
| Anti-CD40 | BD Pharmigen | 553787 | ||
| polybrene | Sigma Aldrich | 107689 | ||
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma Aldrich | C6628 | Used at 100mM | |
| Phoenix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | ||
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | ||
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Pharmigen | A85-1 |
Riferimenti
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