Microdissection الغدد الارملة السوداء الحرير المنتجة العنكبوت
Summary
نحن هنا تصف استراتيجية فعالة لإزالة الغدد المنتجة للحرير من بطن امرأة عناكب الأرملة السوداء. هذا الإجراء يسمح للعزلة السريع للانتاج الحرير seven متميزة الغدد بطريقة عالي النقاء ، وهي عملية هامة للمحققين يدرسون العنكبوت إنتاج الحرير والتجمع الألياف.
Abstract
العناكب الحديثة تدور ألياف الحرير عالية الأداء مع طائفة واسعة من الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك تنقل التقاط الفريسة ، وحماية النامية 1،2 ذرية. العناكب إنجاز هذه المهام من خلال الدوران عدة أنواع الألياف التي لها خصائص مميزة الميكانيكية المختلفة. لقد حدث مثل هذا التخصص من أنواع الألياف من خلال تطور غدد الحرير المنتجة المختلفة ، والتي تؤدي وظيفة وbiofactories الصغيرة. وهذه صناعة biofactories تخزين كميات كبيرة من البروتينات الحرير لإنتاج الألياف. من خلال سلسلة معقدة من الأحداث البيوكيميائية ، يتم تحويل هذه البروتينات الحرير من السائل إلى مادة صلبة عند قذف.
وقد أثبتت الدراسات الميكانيكية التي الحرير العنكبوت أقوى من الفولاذ عالي الشد 3. وقد كشفت التحاليل لفهم العلاقة بين بنية ووظيفة المواضيع التي حرير العنكبوت عنكبوت الحرير تتألف في معظمها من البروتينات ، أو fibroins ، التي يكرر كتلة ضمن تسلسل البروتين 4. ويجري كشف التوقيعات الجزيئية المشتركة التي تساهم في قوة الشد والتمدد لا يصدق من الحرير العنكبوت من خلال تحليلات cDNAs الحرير ترجمتها. نظرا للخصائص المواد غير عادية من الحرير العنكبوت ، ومختبرات الأبحاث في جميع أنحاء العالم تتسابق على فهم ومحاكاة عملية الغزل لإنتاج ألياف الحرير الاصطناعي للاستخدامات التجارية والعسكرية والصناعية. واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه صناعة الغزل الاصطناعي حرير العنكبوت في مختبر البحوث ينطوي على فهم كامل للعمليات الكيميائية الحيوية التي تحدث أثناء قذف من الألياف من الغدد المنتجة للحرير.
هنا نقدم وسيلة لعزل السبع الحرير المنتجة للغدد مختلفة من عنكبوت الأرملة السوداء cobweaving ، والذي يتضمن الغدد أمبولي الشكل الرئيسية والثانوية 7 [dragline بتصنيع الحرير والسقالات] 5،6 ، tubuliform [البيض يجمع الحرير القضية] ، 8 ، سوطي الشكل [وظيفة معروفة في الكوز ، النساجين] ، الإجمالية [يجعل الغراء الحرير] ، عنيبي الشكل [التفاف فريسة يجمع البيض والمواضيع القضية] (9) والكمثري [تنتج الحرير القرص المرفق] (10). ويستند هذا النهج على التخدير العنكبوت مع غاز ثاني أكسيد الكربون ، وفصل لاحق من cephalothorax من البطن ، وmicrodissection من البطن للحصول على الغدد المنتجة للحرير. بعد انفصال في الغدد المنتجة للحرير مختلفة ، يمكن استخدام هذه الأنسجة لاسترداد الجزيئات المختلفة للتحاليل الكيميائية الحيوية المتميزة ، بما في ذلك في الوقت الحقيقي PCR الكمي ، شمال وغرب النشاف ، ويحلل الطيف الكتلي (MS أو MS / MS) لتحديد سلاسل بروتين الحرير الجديد ، والبحث عن البروتينات التي تشارك في مسار التجمع الحرير ، أو استخدام أنسجة سليمة للثقافة الخلية أو التجارب النسيجية.
Protocol
Discussion
منهجيتنا لmicrodissection في الغدد المنتجة للحرير العنكبوت من الأرملة السوداء يوفر وسيلة فعالة للحصول على الحرير عالي النقاء لانتاج الغدد. يمكن أن تكتمل في تشريح 1،5-3 ساعات ، مما أسفر عن مجموعة كاملة من السبعة المتميزة الحرير المنتجة من الغدد cobweavers. الحصول على الحرير عالي ا?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال توصيف NSF المنح RUI MCB – 0950372 الجزيئية يحق للعنكبوت الأرملة السوداء الحرائر.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
Riferimenti
- Vollrath, F., Knight, D. P. . Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. . J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. . Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. . Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. . Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. . Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. . Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. . Biochimica. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. . J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. . Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. . J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
