Questo protocollo descrive la preparazione di un substrato sintetico per il tRNA Entamoeba histolytica DNA / tRNA metiltransferasi 2 (Dnmt2) Ehmeth omologa e la misura della sua attività metiltransferasi. Questo approccio sperimentale può essere utilizzato per indagare l'attività di altre proteine Dnmt2.
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Articolo metodologico
Test in vitro Metilazione tRNA con l'Entamoeba histolytica del DNA e Dnmt2 tRNA metiltransferasi (Ehmeth) Enzyme
In questo articolo
Sommario
Abstract
Protozoi parassiti sono tra gli agenti infettivi più devastanti degli esseri umani responsabili di una varietà di malattie tra cui amebiasi, che è una delle tre più comuni cause di morte per malattie parassitarie. L'agente di amebiasi è l'ameba parassita Entamoeba histolytica che esiste in due fasi: la cisti infettive presenti nel cibo o acqua e la vita trofozoite invasivo a livello intestinale. Le manifestazioni cliniche della gamma amebiasi da essere asintomatica per ascessi colite, dissenteria o di fegato. E. histolytica è uno dei rari parassita unicellulare con 5-metilcitosina (5mC) nel suo genoma. 1, 2 contiene un singolo DNA metiltransferasi, Ehmeth, che appartiene alla famiglia Dnmt2. 2 Un ruolo per Dnmt2 nel controllo di elementi ripetitivi ha stato stabilito in E. histolytica, 3 Dictyostelium discoideum 4,5 e Drosophila. 6 I nostri lavori più recenti hanno dimostrato che Ehmeth metila tRNA Asp, e questo dato indica che questo enzima ha un DNA a doppia / tRNA attività Asp metiltransferasi. 7 Questa osservazione è in accordo con la duplice attività che è stato segnalato per D. discoideum e D. melanogaster. 8 Il significato funzionale del DNA / tRNA specificità del Dnmt2 enzimi è ancora sconosciuta. Per affrontare questo problema, un metodo per determinare l'attività metiltransferasi tRNA Dnmt2 di proteine è stata stabilita. In questo video, si descrive un approccio semplice per preparare un adeguato substrato tRNA per Dnmt2 e un metodo per misurare la sua attività metiltransferasi tRNA.
Protocollo
Premessa prima di iniziare l'esperimento:
- RNasi-free l'acqua viene utilizzata nel trattamento di RNA in laboratorio per ridurre il rischio di RNA di essere degradati da RNasi. A tal fine, l'acqua è di solito trattati con 0,1% v / v diethylpyrocarbonate (DEPC) per almeno 1 ora a 37 ° C e poi in autoclave (almeno 15 min) per inattivare tracce di DEPC.
- Pipette Pipetman vengono puliti con una soluzione la decontaminazione da RNasi (RNase sterminatore, biologico Industria Beit Haemek) prima dell'uso.
- Provette Eppendorf e suggerimenti devono essere certificate come esenti da DNasi e RNasi per preservare l'integrità del campione.
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Discussione
In questa presentazione, abbiamo illustrato come preparare componenti attivi per la misura dell'attività tRNA metiltransferasi di E. histolytica Ehmeth enzima. Questa procedura può servire come punto di partenza ed essere facilmente adattato per la misura della metiltransferasi tRNA altri. E 'importante seguire le procedure che preservano la qualità e l'integrità del substrato tRNA e della proteina tRNA metiltransferasi per assicurare una misura ottimale della attività enzimatica.
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo studio è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation e l'Istituto per la Famiglia Rappaport ricerca nelle scienze mediche, e la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Taq Polimerasi (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| Tampone PCR Gentherm 10X | Rapidozym, Berlin | Incluso in GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | Incluso in GEN-003-1000 | |
| Miscela dNTP (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligonucleotidi | IBA, Göttingen | Su misura | |
| Miscela NTP (25 mM) | Fermentas | R0481 | |
| Colorante per acidi nucleici GelRed 3X in acqua | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Ditiotreitolo | Fermentas | R0861 | |
| Spermidina | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0,45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Diclorodimetilsilano | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Etilene (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Peroxodisolfato di ammonio | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Concentrato per gel di sequenziamento Rotiphorese | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Diluente per gel di sequenziamento Rotiphorese | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Concentrato tampone per gel di sequenziamento Rotiphorese | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Tampone TBE 10X Rotiphorese | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillina | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lisozima | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptina | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonasi nucleasi | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| Reagente per estrazione proteica BugBuster | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Resina di glutathione-agarosio | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| Glutatione ridotto L | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Cocktail di scintillazione | CytoScint | 882453 |
Riferimenti
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S.
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Ristampe e permessi
