Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues
Summary
Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
Abstract
Le monde des odeurs vives est reconnu par le sens de l'olfaction. Olfaction chez la souris est médiée par un répertoire d'environ 1200 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 1 qui sont postulés pour lier les molécules odorantes volatiles et en convertissant le signal extracellulaire en signal intracellulaire par couplage avec la protéine G Gαolf. La liaison de l'odorants aux récepteurs est pensé pour suivre une règle combinatoire, qui est, un odorant peut lier plusieurs récepteurs et un récepteur peut se lier plusieurs molécules odorantes à des degrés divers 2. Biochimiques, la signalisation et des études de liaison ligand ont été commodément effectuée pour la plupart des RCPG en utilisant des cellules hétérologues. Cependant l'utilisation de cellules hétérologues pour l'étude des récepteurs olfactifs, a été exclue pour un temps depuis longtemps sur la transfection ils ont échoué à l'exportation vers la surface. Saito et al ont démontré seule récepteur membranaire passent protéine de transport (RTP) chaperons familiales montrent une expression accrue dans les neurones olfactifs sensoriels et d'agir comme accompagnateur à récepteurs olfactifs du trafic à la surface des cellules hétérologues, en cas de co transfectées ensemble 3. Pour mener à bien des dosages biochimiques des récepteurs utilisant des cellules hétérologues, on doit d'abord déterminer si le récepteur affiche l'expression en surface robuste dans la lignée cellulaire. Cela peut être dosé en surexprimant les récepteurs à la RTP1S chaperon suivie par coloration de cellules vivantes à fluorescence étiquette du domaine extracellulaire ou un tag dans le domaine extracellulaire exclusivement. Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
Protocol
Discussion
Chaque étape doit être réalisée avec soin pour s'assurer coloration de surface importante et distinctive. Le processus de coloration au complet doit être effectué à froid (sur glace), et le plateau sur lequel sont fixées des lamelles doit être refroidi avant de l'utiliser pour assurer les cellules rester en vie. Par ailleurs la fixation est effectuée à la fin du processus de coloration de surface. Ceci est en contraste frappant avec la coloration interne où la fixation précède coloration pour perm?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les membres du laboratoire pour Matsunami lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Scientific | 72200-11 | ||
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000 | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | ||
| Minimal essential medium | Sigma | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | ||
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | ||
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | Gibco | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630 | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium | |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma | P7280 | ||
| Sodium Azide | EM Science | SX0299-1 | ||
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon | 353801 | ||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300 | 0.05% |
Riferimenti
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
