وسم F - أكتين ينتهي شائك مع أكتين - رودامين في نمو الخلايا العصبية Permeabilized المخاريط
Summary
تم وصف طريقة لتصور وتحديد F – أكتين ينتهي الشائكة في مخاريط نمو الخلايا العصبية. بعد زراعة الخلايا العصبية على coverslips الزجاج ، وpermeabilized الخلايا بمحلول سابونين المحتوية. ثم ، وهو حضانة قصيرة مع العازلة التي تحتوي على صابونين رودامين – أكتين يشتمل على تاريخ أكتين الفلورسنت الأكتين الحرة الشائكة.
Abstract
تسمى نصائح متحركة من محاور النمو مخاريط النمو. مخاريط النمو يؤدي التنقل من خلال المحاور الأنسجة النامية من خلال التفاعل مع أعرب محليا العظة التوجيه المستقبلات الجزيئية التي تربط مخروط النمو وتنظيم ديناميات وتنظيم الهيكل الخلوي 3-6 مخروط النمو. الهدف الرئيسي من هذه الإشارات الملاحية هو meshwork خيوط الأكتين الذي يملأ المحيط مخروط مخروط النمو ودفع عجلة النمو الاقتصادي الذي من خلال حركية البلمرة أكتين المستمر وإعادة تشكيل ديناميكية 7. إشارات إيجابية أو التوجيه جذابة لحث مخروط النمو التي تحول خيوط الأكتين تحفيز (F – أكتين) البلمرة في المنطقة للنمو هامش مخروط هو أقرب مصدر جاذب جديلة. هذا بلمرة أكتين محركات النمو المحلية نتوء مخروطي ، التصاق الهامش الرائدة واستطالة محواري نحو جاذب.
خيوط الأكتين البلمرة يعتمد على توافر ما يكفي من مونومر أكتين ونوى البلمرة أو ينتهي خيوط الأكتين الشائكة لإضافة مونومر. أكتين مونومر يتوفر بكثرة في العقدة الجذر الفرخ الشبكية والظهري (DRG) مخاريط النمو. وبالتالي ، البلمرة يزيد بسرعة عندما حرر F – أكتين ينتهي الشائكة تصبح متاحة للإضافة مونومر. هذا يحدث في DRG الفرخ ومخاريط الشبكية النمو عن طريق تنشيط المحلي للأكتين قطع البروتين F – أكتين depolymerizing عامل (ADF / cofilin) في منطقة مخروط النمو أقرب إلى 80-10 جاذب. هذا يزيد ADF / cofilin النشاط يقطع خيوط الأكتين لخلق فرص عمل جديدة من طراز F – أكتين ينتهي الشائكة للبلمرة. الأسلوب التالي يوضح هذه الآلية. المحتوى الكلي من طراز F – أكتين هو تصور من خلال تلطيخ مع phalloidin الفلورسنت. F – أكتين ينتهي الشائكة هي تصور عن طريق دمج أكتين – رودامين داخل مخاريط النمو التي permeabilized للإجراءات المبينة في ما يلي ، وهو مقتبس من الدراسات السابقة من الخلايا متحركة أخرى 11 ، 12. عند إضافة رودامين – الأكتين عند تركيز أعلى من تركيز حاسم لمونومر أكتين بالإضافة إلى نهايات الشائكة ، رودامين – أكتين تجمع على تاريخ الشائكة الحرة. إذا تم عرض جديلة جذابة في الانحدار ، مثل الإفراج عنه من micropipette المتمركزة على جانب واحد من مخروط النمو ، فإن إدماج رودامين – F – أكتين على أكتين ينتهي الشائكة يكون أكبر في نمو الجانب مخروط نحو 10 micropipette .
مخاريط النمو هي هياكل الخلية الصغيرة والدقيقة. كلها إجراءات ، permeabilization رودامين – أكتين التثبيت ، التأسيس والتصور مضان عمله بعناية ويمكن أن تجرى على مرحلة مجهر مقلوب. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لدراسة محلية بلمرة الأكتين في الخلايا العصبية المهاجرة ، وغيرها من خلايا الأنسجة الابتدائية أو خطوط الخلية.
Protocol
Discussion
قدم هنا طرق تسمح القرار الزماني والمكاني من المكونات الخلوية التي تشارك في إعادة عرض ديناميكية الهيكل الخلوي أكتين على هامش الرائدة في مجال الهجرة مخاريط النمو. وكشف عن عمل الجزيئات الجاذبة ، مثل NGF أو netrin ، لتحفيز بلمرة خيوط الأكتين بسرعة وزيادة المحلية في تاريخ أكت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نشكر الدكتور جيمس Bamburg وأعضاء مختبره للتعاون في هذه الدراسات. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح HD19950 ، EY07133 والمنح المقدمة من المؤسسة الطبية ولاية مينيسوتا.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
Riferimenti
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
