La stimulation mécanique des cellules souches en utilisant cyclique uniaxiale souche
Summary
Il est largement reconnu que les forces mécaniques dans le corps peut influencer la différenciation cellulaire et la prolifération. Nous présentons ici un protocole vidéo montrant l'utilisation d'un bioréacteur sur mesure pour livrer uniaxiale souche traction cyclique à des cellules souches cultivées sur des substrats flexibles micropatterned.
Abstract
Le rôle des forces mécaniques dans le développement et l'entretien des tissus biologiques est bien documenté, dont plusieurs phénomènes mécaniques réglementées telles que le remodelage osseux, l'hypertrophie musculaire, lisse et la plasticité des cellules musculaires. Cependant, les forces impliquées sont souvent extrêmement complexes et difficiles à surveiller et à contrôler in vivo. Afin de mieux étudier les effets des forces mécaniques sur les cellules, nous avons développé une méthode in vitro pour l'application de la déformation de traction uniaxiale cyclique pour cellules adhérentes en culture sur membranes élastiques. Cette méthode utilise un bioréacteur conçu sur mesure avec un moteur à rotor à cames système pour appliquer la force désirée. Nous présentons ici un protocole vidéo étape par étape, démontrant comment assembler les différents éléments de chaque «chambre d'étirement», y compris, dans ce cas, une membrane de silicone avec la topographie micropatterned d'orienter les cellules avec la direction de la souche. Nous décrivons également des procédures pour la stérilisation des chambres, l'ensemencement des cellules sur la membrane, la chambre de verrouillage dans le bioréacteur, et en ajustant les paramètres mécaniques (c. ampleur et le rythme de la souche). Les procédures décrites dans ce protocole particulier sont spécifiques pour l'ensemencement des cellules souches mésenchymateuses humaines sur des membranes en silicone avec 10 um canaux larges orientées parallèlement à la direction de la souche. Cependant, les méthodes et les matériaux présentés dans ce système sont suffisamment flexibles pour accommoder un certain nombre de variations sur ce thème: la vitesse de déformation, l'ampleur, la durée, type de cellule, la topographie de membrane, de revêtement de membrane, etc peuvent tous être adaptés à l'application souhaitée ou résultat. C'est une méthode robuste pour enquêter sur les effets des contraintes de traction uniaxiale appliquée à des cellules in vitro.
Protocol
Discussion
Banes et al. D'abord rapporté l'utilisation d'un système de stimulation mécanique des cellules in vitro en utilisant un substrat en élastomère souple pour fournir la force mécanique des cellules 1. Depuis ce temps, beaucoup de variations sur cette conception ont été conçues et utilisées. Plusieurs systèmes de stretch mécanique sont disponibles commercialement sous le nom de "Flexercell" (Flexcell International Corp), tandis que certains laboratoires utilisent des dispositifs sur-mesure. Dans ce p…
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungizone | Reagent | Lonza | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | Gibco | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | Gibco | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | Gibco | 11966-025 |
Riferimenti
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
