İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon
Summary
Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano uyarlanmıştır<em> Ve ark.</em> (2007). Mitokondrial izolasyon prosedürü yaklaşık 2 saat gerektirir. Mitokondriyal solunum yaklaşık 1 saat içinde tamamlanabiliyor.
Abstract
Mitokondri hücrenin yaşam ve ölüm kontrol organelleri. Bunlar önemli metabolik reaksiyonlarda katılmak, ATP sentezlemek ve şelaleri 2,3 sinyal sayısını düzenleyen. Geçmiş ve mevcut araştırmacılar mitokondri, karaciğer, beyin ve 4,5 kalp gibi sıçan ve fareler dokulardan izole var . Son yıllarda, birçok araştırmacı, iskelet kaslarının mitokondriyal fonksiyon eğitimi üzerine odaklanmıştır.
Burada, iskelet kaslarının 6 mitokondri izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim prosedür Tüm tamponları ve reaktifler taze ve iskelet kası hakkında 250-500 mg ihtiyacınız olduğunu gerektirir. Biz, sıçan ve fare gastroknemius ve diyafram izole edilen mitokondri okudu ve sıçan ekstraoküler kasları. Mitokondrial Bradford yöntemi ile protein konsantrasyonu ölçülür. Mitokondriyal numunelerin hazırlanması sırasında ve fonksiyonel çalışmalar nispeten kısa bir süre (~ 1 saat) içinde yapılmalıdır buz gibi soğuk tutulması önemlidir. Mitokondriyal solunum 37 Clark-tipi elektrot (Oxygraph sistemi) ° C arasında 7 polarografi kullanarak ölçülür. Oksijen elektrot kalibrasyonu bu protokolü önemli bir adım olduğunu ve günlük olarak yapılmalıdır. İzole mitokondri (150 mikrogram) deneysel tamponu (EB) 0,5 ml eklenir. Eyalet 2 solunum glutamat (5mM) ve malat (2.5 mM) eklenmesi ile başlar. Sonra, adenozin difosfat (ADP) (150 mcM) devletin 3 başlatmak için eklenir. Oligomycin (1 mcM), bir ATPaz sentaz bloker, 4 devlet tahmin etmek için kullanılır. Son olarak, karbonil siyanür p [trifluoromethoxy]-fenil-Hidrazon (FCCP, 0.2 mcM) 5 measurestate eklendi veya solunum 6 Kuplajsız. Solunum kontrolü oranı (RCR), devlet 4 devlet (3) oranı, her bir deney sonrası hesaplanır. Bir RCR ≥ 4, geçerli bir mitokondri hazırlık delil olarak kabul edilir.
Özetle, biz, uygulanabilir mitokondrinin biyokimyasal (örneğin, enzim aktivitesi, İmmuno, proteomik) ve fonksiyonel çalışmalar (mitokondrial solunum) kullanılabilir iskelet kaslarının izolasyonu için bir yöntem mevcut.
Protocol
Discussion
Biz iskelet kaslarının canlı mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Verimi bir sorun ise, protokol, 30 dakika boyunca buz PBS/10mM EDTA/0.01% tripsin 5 ml izole kas kuluçka tarafından değiştirilebilir. Tripsin ile tam bir kas sindirim sağlamak için, kas tam kıyılmış gerekir. 30 dakika inkübasyondan sonra, PBS/10mM EDTA/0.01% tripsin çözüm tamamen izolasyon tampon 1 (IB1) 3 ml ile değiştirilmesi gerekir. Buna ek olarak, tripsin, mitokondriyal solunum protokol sırasında bazı substratlar en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, FH Andrade Ulusal Göz Enstitüsü (R01 EY12998) bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
Riferimenti
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
