1. Inledning Den selektiva leverans av läkemedel och terapeutiska makromolekyler (peptider, proteiner och nukleinsyror) för cell-och vävnad platser av aktiv sjukdom och pågående infektioner mikrobiell kommer att förbättra läkemedels-svar under sjukdom 1-3. En särskild cellulära webbplats är makrofager som är både mycket mobil och immun engagerande och är en konsekvent främsta mål för humant immunbristvirus (HIV). 4 Viktigt makrofag engagerade inflammation också ligger bakom en rad sjukdomar som bland annat degenerativa, inflammatoriska, infektiösa och cancersjukdomar, och cellens rörlighet sjukdom platser ligger bakom utvecklingen av vävnad skador 5-9. Viktigt har användningen av blodburna makrofager som drog, makromolekyl, och transportörer signal fick nyligen uppmärksamhet för sin translationell potential. Det är dock ett betydande hinder för att förverkliga terapeutisk potential blod-hjärnbarriären (BBB) bland andra vävnader hinder som är ogenomtränglig för ett spektrum av makromolekyler och proteiner. Dessa hinder, ändå tillåter cellen passage. Sammantaget är det beräknade att det naturliga förloppet av sjukdomen perifer makrofager som kringgår hinder kan bära formulerade droger, markörer och peptider till webbplatser av infektion eller inflammation. Trots sådana tekniker återstår bara i utvecklingen. Det är genom våra arbeten som cellmedierad leverans kan utvecklas för diagnostiska och terapeutiska tillämpningar och sådana ansökningar stöds av laboratorie-och djurmodeller för mänskliga sjukdomar 10-12. 2. Nanomaterial Förberedelser Beredning av nanomaterial för drug delivery och studier biodistribution är ämnet för en parallell manuskript i denna fråga (referens parallel manuskript). Alla förfaranden för kristallina nanopartiklar tillverkning sker i ett laminärt flöde huva. Alla ytor är desinfekteras före användning med 70% alkohol. Detta inkluderar arbetsyta, utsidan av handskar och eventuella spill. Alla är täckt med lösning av replikera 70% alkohol omedelbart med våtservetter. Handskar kastas efter användning och inte användas vid att något annat laboratorium område. Hjälpämne, droger, sterilt vatten med / innehåller något / alla reagens för tillverkning av läkemedelsavgivande sk lastade partiklar endast förs in arbetsområden när det behövs för förfaranden. Sterila insvept pipetter används endast och kasseras efter användning i en biologiskt avfallsbehållare. Den våta villiga Apparaten är desinficeras med sprit före och efter användning. Arbetsområdet rengörs omedelbart före och efter med 70% alkohol. Nanopartiklar lösning testas för pyrogen i enlighet med FDA riktlinjer för att bedöma frånvaron av bakteriella endotoxiner i lösningar läkemedel partikel användas för djur. Kortfattat, Kandidat nanoformulations för in vivo-bruk replikeras genom att ersätta drogen kärna eller droppar med en identisk storlek partikel eller fräst bit superparamagnetiska järnoxid (SPIO) innan beläggning med lämpliga tensider. Detta följs av åtgärder storlek, laddning, form och cytotoxicitet för att avgöra om SPIO modellsystem har samma egenskaper som den nanoformulated läkemedelskandidaten. Slutligen cell lastning analyser som utförs genom inkubering med kandidaten SPIO modell nanoformultation för att bestämma relaxiviteten inne i cellerna med hjälp av fantomer som består av märkta celler svävande i agargel. Phantoms är upprättad i tre exemplar och är beredda på en serie koncentrationer för att kvantifiera relaxiviteten grund av SPIO upptag i celler. Detta ger ett index på känslighet och avgör om nanoformulations kan påverka oxidationstal och därmed synlighet SPIO i magnetisk resonanstomografi (MRT) genomsökningar. 3. Metoder och arbetssätt: Animal Förberedelser Injektioner / katetrar. Beroende på tid av intresse, kan injektionerna kräver användning av en kateter för att injicera djuren inom MRI. Katetrar är beredda att använda en icke-magnetisk nål och en slang förlängning med minsta diameter för att minimera Dead Space i injektion linje. Katetern bör vara förifyllt med antingen den lösning som innehåller nanomaterial ska injiceras eller saltlösning, beroende på dead space och den totala acceptabel volym injektion. Om möjligt kan injektionen följas med en fysiologisk koksaltlösning färg. Om akuta tider inte är av yttersta vikt, kan en pre-scan ska utföras, och injektionen kan göras utanför magneten på en förutbestämd tid innan uppföljningen söker efter biodistribution åtgärder. Katetrar är vanligtvis in i svansvenen för IV injektioner. Anestesi och övervakning. Innan skanning, är djuret placeras i en kammare för att inducera anestesi. Denna kammare är förifyllt med 1,5% isofluran hos 70% nitrous oxid och 30% syrgas för att skynda på anestesi i djuret och minimera den tid som krävs för att säkerställa att djuret inte kommer att vakna upp efter att de avlägsnats från kammaren. När djuret är helt sövda, är djuret avlägsnades från kammaren och placeras i stereotaktisk innehavaren utrustade för att övervaka andningsfrekvens och temperatur av djuret samtidigt som man fortsätter att leverera isofluran under uppsättning och skanning. Animal Innehavare och överväganden justering: Ställ upp inkluderar öga smörjmedel för att skydda mot hornhinnan sår. Djuret är lätt lindade med gasbinda och gasväv är tejpade för att minimera värmeförluster vid skanning och för att ge ett positivt tryck mot andning monitorn. Djurens innehavare är utrustade med justerbara tand barer, vilket möjliggör vertikal och horisontell justering av huvudet. Detta är särskilt viktigt för höga fält MR, som vinkling av huvudet i stjärtfenan-rostralt riktning kommer att orsaka ytterligare problem med magnetfält homogen grund av magnetisk susceptibilitet. Magnetfält homogen är skadlig för hög kvalitet T 2 * MR samt ett H resonans spektroskopi (1 H MRS) och magnetisk resonans diffusion tensor imaging (DTI). Förutom att korrekt placering av huvudet vinkeln i stjärt-rostralt riktning, bör rotationer av huvudet undvikas i den utsträckning som är möjligt. Möjliggör rotation av djuret hållaren i magneten kommer att ge kompensation för mindre rotationer, vilket kan ske från djur till djur. Detta kan ytterligare minimeras genom noggrann placering av huvudet och uppmärksamhet på vinklade innan du sätter djuret in i MR-systemet. Kalibrering och mellanlägg: När djuret är i hållaren och ytan spolen är korrekt placerad på huvudet, är utgångsläget för djuret bestäms av en i realtid endimensionella avläsning i stjärt-rostralt riktning. Signal är begränsad till området runt ytan spole som används för mottagning, vilket begränsar behovet av tolkning av de observerade vågen former. När den första positionen är bestämd, är ett 3-plan localizer bild tagen för att bestämma den exakta positionen för djuret i skannern och möjliggöra rörelse till den exakta platsen som krävs för skanning (ar) av intresse. Detta följs av justering av homogenitet magnetfält eller "mellanlägg" magneten. Detta görs genom att kartlägga området distribution och beräkning av en exakt bestämd rumslig korrigering baseras på uppmätta svar av en serie av elektromagneter och "spolar shims" inom systemet utformat för att anpassa fältet homogenitet. Mellanlägg sker med hjälp av en multi-gradient eko sekvens och kartläggning programvara utvecklad av Dr Hetherington 13. Regioner i homogenitet matchas till regionen undersöks av varje enskild avbildningsmetod. När mellanlägg är klar kan vi förvärva scan (ar) av intresse från djuret. 4. Data Acquisition Hög upplösning T 2 * viktade MRT. Biodistribution i SPIO innehåller nanopartiklar kan bestämmas genom att upptäcka områden i signalförlust i hög upplösning 3D-T 2 * viktade MRT. Den region i hjärnan bestäms utifrån Localizer skannar och föreskrivet på Localizer skannar eller ytterligare skanningar efter behov. AT 2 * viktade MR-undersökning med 150 micron isotrop upplösning är då förvärvas. En högupplöst 3D gradient påminde eko MR-undersökning av musen huvudet förvärvas med hjälp av en 25 mm spole fågelbur volym med förvärvet parametrar för eko tid = 5 ms, upprepning tid = 50 ms, 30% eko, flip vinkel = 35 grader, medelvärden = 2, synfält = 20 x 20 x 20 mm med en upplösning på 128 x 128 x 128 (Voxel size = 150 x 150 x 150 ìm 3), total förvärv gång = 30 min. Diffusion Tensor Imaging (DTI): Diffusion tensor bilder är kvantitativa mått på inriktningen och omfattningen av spridningen av vatten i cellerna i vävnaden. Som ett resultat, är den fas av signalen extremt känsliga för rörelse, som skannar de är känsliga eller "viktade" för mikroskopisk vatten rörelse. Som ett resultat, är enda skott förvärv önskat att förhindra fas förskjutningar mellan förvärv från att orsaka signal utsmetning, och respiratoriska gating krävs för att förhindra grova rörelse under signalen förvärv. Därför, herr sekvens en respiratorisk gated spin-eko diffusion viktade echo planar imaging (EPI) är anställd. Återigen, mellanlägg regionen av skanningar är mycket viktigt, eftersom off-resonans effekter under utvecklingen av den signal orsakar felregistrering av signalen frekvens, och därmed position i planet av bilden. EPI förvärvet parametrar som ingår 14 skivor, 200 kHz bandbredd, 96 x 96 i plan förvärv noll fylld till 256 x 256, och en 0,5 mm slice tjocklek. Spridning kodning som användes var en balanserad, rotationssymmetrisk-invarianta och alternerande polaritet ikosahedra system (12 direktivtioner) 14,15. Kodningen ordningen var utformad för att minska bakgrunden-diffusion gradient kopplingar 16. Diffusion viktning b-faktorn = 800 s mm -2, δ = 4 ms, Δ = 15 ms, Gdmax = 40 g / cm, 200 ìs stigtid, 7 medelvärden för b = 0 anskaffning, 3 medelvärden för varje B = 800 kodning riktning, för en total förvärv tid på 20-40 min, beroende på andningsfrekvensen. Lokaliserad 1 H resonans spektroskopi (1 H MRS): 1 H MRS kan erhållas från hjärnan föreskrivna på bilder som förvärvats under samma avbildning session. Anatomiska platser finns på bilderna för att föreskriva regionen av intresse för att förvärva spektra. När regionen har identifierats, mellanlägg utförs på en region matcha volymen av förvärv, kontrolleras med hjälp av en lokal vatten spektrum. Sedan är kraften i pulser vatten dämpning optimerad är vatten frekvens mäts för att försäkra sig om resonans vatten signal, och en kort test spektrum förvärvas för att ge kvalitetskontroll. Om spektra av otillräcklig kvalitet, systeminställningar, inklusive radiofrekvent (RF) makt och inställningar shims, kontrolleras. Slutligen, om kvaliteten är fortfarande otillräcklig, är en andra 3-planet localizer springa för att säkerställa att djuret inte har flyttats från den ursprungliga skanningar. Enligt vår erfarenhet ger detta en mycket hög grad av reproducerbarhet och noggrannhet för spektroskopiska förvärv. Slutligen är de spektra förvärvas i korta block med återställning av systemet frekvensen mellan förvärv för att eliminera effekterna av magnetfält med vinden och för att säkerställa reproducerbarhet och kvalitet i den slutliga skanningar. I slutet av förvärvet är en enstaka puls vatten spektrum vid en förutbestämd förförstärkare få användas som ett kvantitativt signalens amplitud referens. Histologi och Blockface Imaging: Efter den sista MRT session i tiden serie experiment, är musen perfusion, är hjärnan bort och inbäddad i ett block av oktober, förening som har mörkare med hjälp av en droppe tusch. Blocket placeras i en kryostat för skivning och histologisk analys. Blockface bilder förvärvas med hjälp av en digitalkamera (Canon EOS Digital Rebel 300D med ett Canon Ultrasonic EFS 60mm f/2.8 Macro USM objektiv) monterad på framsidan av kryostat med en egen montering och utlösas av en fjärrstyrd strömbrytare. Digitala bilder förvärvas var 50 mikrometer genom hela hjärnan volym. Segment är numrerade för att möjliggöra registrering inom volymen efter histologiska behandling och färgning. Individuella blockface skivor anpassades till rekonstruera 3D-volymen med hjälp av blocket riktlinjer att ta hänsyn till jitter i position kryostat huvudet. Hjärnan volymen automatiskt segmenterade använda utsäde baserade regionen växer algoritm i Analyze programvarupaket (AnalyzeDirect, Lexena, KS). 5. Data Analyser SPIO upptäckt med hjälp av MRT: SPIO orsakar signalförlust i T 2 * viktad MRT-bilder, och som sådan är MR-signalen ogiltig en känslig men inte specifik markör för SPIO närvaro i vävnad. Känsligheten är beroende av den rumsliga upplösningen av MRT och storleken på SPIO partikel, med en enda micron storlek partikel detekteras med 100 mikron isotrop upplösning. I dessa verk är 150 micron isotropiska upplösning med 200 nanometer stora SPIO partiklar används. Att ge både sensitivitet och specificitet för förekomst av SPIO i hjärnan, möss scannade före injektion av de märkta SPIO cellerna så att subtraktion bilder som ska användas för positiv identifiering av celler i hjärnan vid senare tidpunkter. 3D MRT var subimaged med begränsad metod nivå som utvecklats i vårt laboratorium som tidigare beskrivits 17. Subimaged hjärnvolym var då coregistered, signalstyrka normaliserats och volymerna subtraheras för att upptäcka områden i hjärnan volymen med signalförlust (närvaro av SPIO), som inte var längs kanterna för att eliminera positiva falsk signal från någon subpixel registreringen fel. Coregistration för histologi och MRI: Coregistration mellan histologi och MRI uppnåddes genom att använda blockface bilden som en gemensam referens. Denna metod minskar komplexiteten i det stora problemet att korrigera den asymmetriska krympning av vävnad skivor under beredning och färgning till ett tvådimensionellt problem som beskrivs i vår tidigare verk 18,19. Här har MR och histologi upptäcka SPIO innehåller makrofager i hjärnan visat utmärkt rumslig korrelation, med en förväntad överskattning av volymen genom förlusten i MR-signalen och större känslighet för få celler framgår av histologi 12. Exakt co-lokalisering av dessa två signaler ger ett mått på noggrannhet coregistration och skevhet i histologi tillbaka till det ursprungliga former av skivor. Regionen av intresse (ROI) Analyser av DTI: DTI skannar normalt analyseras genom val av en anatomisk ROI för determine den genomsnittliga spridningen egenskaper vävnaden i en viss anatomisk underkonstruktion. Analyser av diffusion-viktade uppgifter utförs med anpassade program skrivna i IDL (Interactive Data Language, ITT Visuell Information Solutions, Boulder, CO) som tidigare beskrivits 15,20. Analyser producera kartor över tensor diffusivities (λ 1, 2 λ, λ 3), genomsnittlig diffusivitet (D AV) där: D Av = (λ 1 + λ 2 + λ 3) / 3 och fraktionerad anisotropi (FA), där: Tvärgående (λ ⊥ = (λ 2 + λ 3) / 2) och longitudinella (λ ll = λ 1) delar av diffusion tensor erhölls som beskrivs på annan plats 21. När kartor är konstruerade, är ROI dras på T 2 viktade MR överdrog med färg kodade λ 1 riktverkan kartor. Exempel på regioner som valts ut för analys i HIV musmodell visas i figur 1. Spektroskopiska Analys: Kvantifiering av det metabola föreningar som bidrar till topparna av hjärnan 1 H MRS är bestämmas enligt ett av en mängd olika metoder kurvan montering. En rad olika tekniker kurvanpassning har utvecklats. I vårt laboratorium använder vi en gång metod domän montering (QUEST) 22 i jMRUI 23 signalbehandling paket som är en linjär kombination av individuella metabolit spektra som bidrar till den slutliga spektrumet. Vi använder en bas uppsättning av 22 enskilda metaboliter som potentiella bidragande faktorer. Grunden spektra simuleras och kontrolleras med hjälp av spektra av lösningar för enskilda metaboliter. Ett exempel på en kurva passar resultat från ett enda spektrum visas i figur 2. 6. Representativa resultat Exempel på DTI och 1HMRS visas i figur 1 och 2. Ytterligare exempel på 1H MRS 24-26 och DTI 27 resultat kan ses i våra tidigare publikationer. Exempel på preinjection T 2 * viktad MRT-bilder med en överlagring av lokalisering av märkta celler i gula visas i figur 3. Musen hade märkt monocyter härrör makrofager injiceras i svansvenen. Fem dagar senare * viktade MR T 2 har samlats in och bearbetats enligt beskrivningen ovan. Musen har utarbetats av injektion av HIV-infekterade mänskliga makrofager in i hjärnan, som ses som en linje av upptäckta musen monocyter härrör makrofager. Ytterligare exempel på både upptäcka märkta celler och coregistration med histologi kan ses i våra tidigare publikationer 10,12. Figur 1. Avbildningar av regioner analyseras för DTI statistik. Figur 2. Spektroskopiska montering med hjälp av QUEST i jMRUI signalbehandling svit. Figur 3. Detektering av SPIO märkta celler migrerar från perifert blod i en hjärna region med fokal encefalit. Cell positioner (gul) overlay representant skivor från en T 2 * viktad MRT-förvärvet som beskrivs i texten.